| 研究概要 |
1)移植細胞の分化段階別移植効果の検討について
移植細胞の段階に応じた細胞を収集する実験的手段として、Nrl,Crx, Rhoプロモーター下にGFPを挿入したベクターを作成し、さらに効率よい導入を図るため、レンチウィルスを作成した(Nrlプロモーター、ロドプシンプロモーター)。これらを用いてNr1陽性細胞をソートし、組織培養網膜と共培養したところ、網膜内に侵入し、ロドプシン陽性となる細胞を得ることができた。これをもとに、今後同様のシステムを用いてマウスまたはラット眼内にNrl及びCrx陽性細胞を移植し、その定着、分化について比較をする準備がほぼ整った。
2)移植細胞の選別方法の検討
移植細胞の選別については、レクチンカクテルを用いて、Rx陽性細胞を倍以上に濃縮し、Rxによる選別に比べ大きく遜色なく効率の良い視細胞分化細胞を得るプロトコールを確立した。しかし、最終的に移植に用いた時の純化効率としては、Rxによるソートに比べて有意に劣ることはないものの、依然不十分と思われ、さらなる純化手段の検討が望まれる。これに関しては、前述プロモーターを用いての抗生剤耐性遺伝子導入による2次的純化なども検討中である。
3)移植環境の検討
組織培養の網膜において、障害後まずnestinが、ついでGFAPがミュラー細胞で発現増強することを確認した。まだ、実験過程において、生体障害モデルにおいてはマイクログリアの反応も重要であることがわかってきたため、変性過程におけるマイクログリアの集積の経路的な変化、障害モデルによる違いなども検討を行い、今後の移植タイミングの基礎となるデータを蓄積中である。また、機能評価のための網膜電位図の測定システムもセットアップを行った。
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