| 研究課題/領域番号 |
19592145
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
服部 高子 岡山大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 助教 (00228488)
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| 研究分担者 |
滝川 正春 岡山大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 教授 (20112063)
久保田 聡 岡山大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 准教授 (90221936)
西田 崇 岡山大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 助教 (30322233)
青山 絵理子 岡山大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 助教 (10432650)
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| キーワード | BAC recombination / Sox9 / X型コラーゲン / 肥大軟骨層 / トランスジェニックマウス / 内軟骨性骨形成 / 大腸菌内相同組換え / bacterial artificial chromosome (BAC) |
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| 研究概要 |
1.相同組換えのためのpLacH-Co110-Sox9-hGHpolyA-FRTneoFRT vectorの作製
mouse Sox9 cDNAをライブラリから単離し、内因性Sox9と区別するため、N-末端にFLAGタグを、また、Sox9 mRNAの転写を集結させるためにhuman growth hormone(hGH)poly adenylation(po1yA)を連結し、さらにBAC DNAとの相同組換え時における選別マーカとしてneo/kan抵抗性遺伝子を連結した。このSox9-hGHpolyA-FRT-neo断片をBAC DNA中のCol10al promoterの下流に相同組換えにより挿入するために、5'側に130bpのExon2中の開始コドンを含まない領域と相同な配列を持つ断片を、また、3'側にはExon2とIntron2の一部を含む57bpの領域と相同な配列を持つ断片を連結した。
2.大腸菌内相同組換えによるBAC RPCI23-192-A7へのCol10-Sox9-hGHpolyA-FRTneoFRT断片の挿入
熱誘導型recombinase(flpe)が組み込まれた大腸菌EL250へのBAC RPCI23-192-A7のエレクトロポレーションによる導入を行い、このBAC DNAはchloramphenicol耐性遺伝子を有している事より選別を行った。次にEL250/RPCI23-192-A7へのColX-Sox9-hGHpolyA-FRTneo断片のエレクトロポレーションによる導入を行い熱誘導によりrecombinaseを発現させ、大腸菌内BAC DNAとColX-Sox9-hGHpolyA-FRTneo断片との相同組換えを行った。コントロールとして、熱誘導をかけず、recombinaseを誘導しない群と比較した。その後、PCR,シークエンシングによって相同組換えが正確に起こっていることを確認した。
3.組換えBAC/Col10a1-Sox9-hGHpolyA-FRTneoFRTのマウス胚への遺伝子導入のための調製および
マウス胚へのBAC/Col10a1-Sox9-hGHpolyA-FRTneoFRTの導入
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