| 研究課題/領域番号 |
19592153
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| 研究機関 | 北海道医療大学 |
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研究代表者 |
田隈 泰信 北海道医療大学, 歯学部, 教授 (40095336)
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| 研究分担者 |
荒川 俊哉 北海道医療大学, 歯学部, 講師 (40306254)
岡山 三紀 北海道医療大学, 歯学部, 助教 (30382500)
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| キーワード | 唾液腺 / 開口分泌 / siRNA / SNARE / GFP |
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| 研究概要 |
全反射顕微鏡TIRF-M(total internal reflection fluorescence-microscopy)では、カバーグラスに接着した細胞膜とその近傍だけにエヴァネッセント励起光が照射されるため、背景光が低く、典型的な開口分泌では分泌物の蛍光が一瞬花火のように広がる像が観察されている。今回、我々はGFP標識したヒト成長ホルモン(hGH-GFP)の分泌像をTIRF-M観察するとともに、SNAREタンパク質の機能解析への応用を模索した。【方法】HeLa細胞にhGH-GFPを発現し、ポータブル炭酸ガスインキュベーター中で培養しながら、Nikon社製100倍TIRFレンズと浜松ホトニクス社帛AQACOSMOSで制御されたEM-CCDカメラを用いTIRF-M観察をおこなった。同様に、GFP標識したVAMP-8をHela細胞に導入し開口分泌における役割を解析した。【結果と考察】HeLa細胞にhGH-GFPを発現し、TIRF-M観察したところ、素早く動く球形または長いチューブ状の小胞が細胞中央のゴルジ信卉から細胞周辺部の突起部に移動しそこで分泌したが、典型的な分泌像は観察されず、hGH-GFPの蛍光は突然消失した。ただし、まれではあるがスパークをともなった典型的な分泌像も観察された。GFP標識したVAMP-8もhGH-GFPと同様に球形または長いチューブ状の小胞に発現し、細胞周辺部の突起部で分泌像を示した。分泌像は、バースト型と非バースト型の二つのタイプがあり、バースト型は一般的なfull-fusion型、非バースト型はkiss-and-run型と考えられた。今後は、これらのプラスミドおよび各種siRNAをラットの顎下腺に導入し、唾液腺細胞内での動態を解析する予定である。
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