| 研究概要 |
古細菌の細胞膜に存在するハロロドプシン(HR)は, 光エネルギーを用いて, Cl-イオンを細胞外から細胞内へ輸送するポンプ蛋白質である. 本課題では, その分子機構を明らかにすることを日指した研究を行っている. 本年度は, 設定している二つの目標について以下に示す成果を得た.
1. 光反応サイクルの精密化
HR内部のLys残基には, 発色団レチナールがシップ塩基結合している. HRは, レチナールの光異性化反応をきっかけとした光反応サイクル中にCl-イオンを輸送する. このサイクル中に起こるイオン輸送ステップを明らかとするため, 本年度は, (1)シップ塩基近傍の酸性及び芳香族アミノ酸残基変異体のフラッシュフォトリシスと活性評価, (2)誘電体薄膜を用いた活性測定系の構築を行った.
(1)作成した変異体の全てで, Cr輸送能はほぼ消失していた. これらの残基の重要性は, 本研究によって初めて明らかとなった事実である. これらの残基は, 光反応サイクル初期の構造変化に重要な役割を担っているという知見を得た.
(2)原子層堆積法によって作成した厚さ50〜200nmのAl_2O_3膜にHRを吸着させ, HRの光励起に伴う誘導電流を測定する系を作成した. 高塩濃度下では感度が悪くなるものの, 低塩濃度下では, 数百pAという, 他の類似した方法に比べて非常に大きな光誘導電流が, 再現性良く得られることが明らかとなった.
2. イオン輸送過程における構造変化の検出
一般に, 蛋白質の大きな構造変化は体積変化を伴う. HRの光反応サイクル中における体積変化の有無を調べる目的で, 高圧力下におけるフラッシュフォトリシスの予備的な測定を行った. 光反応サイクルの幾つかのステップでHRの体積変化が起こっていることが明らかとなった. この体積変化は,HR内部での水分子の脱吸着を反映していると考えられる.
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