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本研究課題では、従来の宿主域同定実験とは全く異なる、以下の4つのステップから構成される新規なファージの宿主域同定技術を開発することを目的とする。(1)核酸染色剤で染めたファージを微生物叢に感染させ微生物を光らせる。(2)FACS(fluorescence activated cell sorting)技術により、ファージに感染した'光った'微生物細胞を特異的に回収する。(3)回収された微生物細胞からDNAを抽出し、16S rRNA遺伝子を決定することで、どのような種類の微生物がファージの感染を受けたのかを決定する。(4)そのクロスチェックとして、回収されてきた微生物細胞の16S rRNAに特異的なDNAプローブをデザインし、先の(1)の核酸染色剤によるファージ標識技術と微生物の16S rRNAを標的としたFISH(fluorescence in situ hybridization)法による2重染色により確認を行う。
本年度は、ステップ(1)とステップ(2)をT4ファージと大腸菌をモデルとして本手法の開発を開始した。T4ファージを核酸染色剤SYBR Goldで染色し、大腸菌への最適な感染時間等の検討を行った。続いてT4ファージが感染した大腸菌細胞を固定してFISH法を行ったところ、FISH法による大腸菌細胞の検出はできたが、ファージ由来の核酸染色剤が著しく槌色してしまうという問題が発生した。この間題を克服すべく、FISH法における反応液の組成を改良したところ、核酸染色剤の槌色を防ぐことに成功した。続いて、ステップ(2)のFACSを用いたファージ感染細胞の分取の条件検討を行った。
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