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本年度の研究計画1)p53四量体形成ドメイン変異体cDNAライブラリーの作製に関しては、ランダムオリゴプライマーを用いてPCR法によってcDNAライブラリーを作製した。2)培養細胞発現系を用いた機能的スクリーニング用のレポーター細胞の作製に関しては、DNA結合ドメイン変異体p53を安定に発現した細胞を得ることができた。この細胞を用いて変異体p53のドミナントネガティブ効果についての検討を進めている。また、p53の機能的発現に伴うアポトーシス等の影響を回避するために迅速に細胞をスクリーニングする必要があるために、レポーターとしてNa/K-ATPaseを利用するためのベクター系の作製と、一過性にp53の発現を制御するための自己切断型リボザイム配列を翻訳開始点直前に組み込んだベクターを作成した。これらのベクターを用いて研究計画3)のホモ四量体形成変異体p53をスクリーニングする条件の検討を進めている。研究計画4)無細胞タンパク質合成系によるmRNA結合タンパク質ライブラリーの作製については、1)で作成したcDNAライブラリーを鋳型として合成したmRNAの3'末端に結合させるPEG PuromycinのPEG部分を、市販されているスペーサー18アミダイトを複数カップリングすることで合成した。mRNA結合タンパク質ライブラリーの作成と研究計画5)ホモ四量体形成ドメインp53変異体タンパク質のスクリーニングに向け、mRNAへのPuromycinアダプターの結合および翻訳条件の検討を行っている。また、申請時の研究計画には無かった酵母のTwo-hybrid系を応用して、ホモ四量体形成変異体p53のスクリーニングを行う実験系を企画し、それに必要となる基本的なプラスミットを作製することができた。この酵母発現系を利用した機能的スクリーニング法の有効性についても検討を進めている。
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