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2008 年度 実績報告書

新世代エキソサイトーシス光学プローブの開発

研究課題

研究課題/領域番号 19659051
研究機関東北大学

研究代表者

八尾 寛  東北大学, 大学院・生命科学研究科, 教授 (00144353)

キーワードシナプトフルオリン / エキソサイトーシス / シナプス小胞 / シナプトブレビン / FRET / GFP / PC12 / 小胞ダイナミクス
研究概要

VAMP-pHluorin(シナプトフルオリン)は、pH感受性GFP改変タンパク質であるpHluorinを、シナプス小胞膜タンパク質であるVAMP-2(Synaptobrevin-2)のC末端側に融合させたものである。シナプス小胞内腔のpHは、エキソサイトーシス、エンドサイトーシスなどの過程で酸性(pH 5.6)→中性→酸性に変化する。VAMP-pHluorinの蛍光変化により、小胞ダイナミクスをリアルタイムに可視化するのが、シナプトフルオリン法である。従来の方法に比べ、シナプトフルオリン法によるエキソサイトーシス計測は高い感度を有しているといえる。しかし、(1)神経活動の際、内因性物質であるフラボンタンパク質(FAD)などに由来する自家蛍光がVAMP-pHluorinのS/Nを低下させる、(2)酸性環境におけるpHluorinの蛍光が微弱であり、VAMP-pHluorinを発現している終末を非活動時に形態的に同定するのが難しい、といった問題点が残されていた。造礁サンゴのDiscosoma種由来の蛍光タンパク質DsRedの改変体モノマーのひとつmOrangeは、pHluorinよりも長波長側に励起蛍光波長を持つ。本研究では、mOrangeのpH感受性を蛍光分光光度計で計測し、pKaを求めた。得られたpKaは7.1であり、mOrangeを用いることにより、S/Nが改良される可能性が示唆された。さらに、黄色蛍光タンパク質EYFPをドナー、mOrangeをアクセプターとするFRETによるレシオ型pHセンサーの作成を試みた。しかし、期待通りのFRETを得るには、リンカー部分の改善がさらに必要である。しかしVAMP-mOrange単独であっても、S/Nに改善が期待されるので、これを検証する目的で、VAMP-mOrangeをゲノムに導入したPC12細胞のin vivoの分泌システムを構築した。

  • 研究成果

    (6件)

すべて 2009 2008

すべて 雑誌論文 (4件) (うち査読あり 4件) 学会発表 (2件)

  • [雑誌論文] Photocurrent attenuation by a single polar-to-nonpolar point mutation of channelrhodonsin-22009

    • 著者名/発表者名
      八尾寛, 他
    • 雑誌名

      Photochem. Photobiol. Sci 8

      ページ: 328-336

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Molecular determinants differentiating photocurrent properties of two channelrhodopsins from Chlamydomonas2009

    • 著者名/発表者名
      八尾寛, 他
    • 雑誌名

      J. Biol. Chem 284

      ページ: 5685-5696

    • 査読あり
  • [雑誌論文] β-Phorbol ester-induced enhancement of exocytosis in large mossy fiber boutons of mouse hippocampus2009

    • 著者名/発表者名
      八尾寛, 他
    • 雑誌名

      J. Physiol. Sci 59(印刷中)

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Noradrenergic excitation of a subpopulation of GABAergic cells in the basolateral amygdala via both activation of nonselective cationic conductance and suppression of resting K^+ conductance : A study using glutamate decarboxylase 67-green fluorescent protein knock-in mice2008

    • 著者名/発表者名
      八尾寛, 他
    • 雑誌名

      Neuroscience 157

      ページ: 781-797

    • 査読あり
  • [学会発表] PKC-dependent reorganization of vesiclular dynamics during presynaptic unscilencing2008

    • 著者名/発表者名
      八尾寛, 他
    • 学会等名
      第31回日本神経科学大会
    • 発表場所
      東京国際フォーラム
    • 年月日
      20080709-11
  • [学会発表] Phorbol ester-induced reorganization of vesicular dynamics at the hippocampal mossy fiber terminals2008

    • 著者名/発表者名
      八尾寛, 他
    • 学会等名
      Neuroscience 2008, the Society for Neuroscience's 38th annual meeting
    • 発表場所
      Washington, DC (USA)
    • 年月日
      2008-11-15

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公開日: 2010-06-11   更新日: 2016-04-21  

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