| 研究概要 |
平成19年度はindoleamine 2,3-dioxygenase (IDO)発現アデノウイルスの大量精製を試みた。まず、マウスIDO発現プラスミドを作成し、Western blotにて発現を確認した。さらにこのマウスIDO発現プラスミドをCHO細胞にトランスフェクションし、培養上清中のトリプトファンおよびキニュレニン濃度をHPLCで測定した。CHO細胞にIDOを発現させることにより、培養上清中のトリプトファン濃度は減少、キニュレニン濃度は増加し、発現したIDOが酵素活性を有していることが示された。ついでこのcDNAおよびpAdenoVator-CMV5-IRES-GFPを用いて、マウスIDO発現アデノウイルスを作成した。2次ウイルスの段階では良好なIDO発現がWestern blotにて確認できたが、3次、4次ウイルスの段階でウイルスタイターの急激な低下を認め、ウイルス粒子の超遠心法による精製が困難となった。そこで、研究計画を修正し、リコンビナントレトロウイルスによりIDOを樹状細胞(DC)に強制発現させることとした。IDO発現率を容易に定量できるように、IRESおよびGFPを有するレトロウイルスベクターpMXs-IG(東京大学 北村俊雄教授より供与)を用いて現在IDO発現レトロウイルスを作成中である。次年度は、IDO発現レトロウイルス(pMXs-IG/IDO)を用いて、pMXs-IG/IDO感染DCのphenotype同定、抗原特異的T細胞増殖・サイトカイン産生に対するpMXs-IG/IDO感染DCの抑制作用、 pMXs-IG/IDO感染DCによるT細胞のIDO発現誘導とpMXs-IG/IDO感染DCがT細胞機能に及ぼす効果、CIAモデルマウスを用いたpMXs-IG/IDO感染DCのin vivo機能を評価する動物実験を実施する予定である。
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