| 研究課題/領域番号 |
19659391
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| 研究種目 |
萌芽研究
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| 研究機関 | 国立成育医療センター(研究所) |
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研究代表者 |
工藤 寛枝 国立成育医療センター(研究所), 移植・外科研究部, 共同研究員 (20425713)
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| 研究分担者 |
浅原 弘嗣 国立成育医療センター(研究所), 移植・外科研究部, 部長 (70294460)
味八木 茂 国立成育医療センター(研究所), 移植・外科研究部, 共同研究員 (10392490)
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| キーワード | 発生・分化 / 発現制御 / 再生医学 / 応用動物 / 遺伝子 |
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| 研究概要 |
本研究では、腱発生時特異的に強く発現するホメオボックス遺伝子である'Mohamk'の、[I]腱の発生・分化における機能解明、[II]腱損傷時の再生における分子メカニズムの解明、以上の2点を目的とし、解析を行っている。本年度は、Mohawkの遺伝子座にEGFPの変異体であるVenus遺伝子を導入した'ノックイン'マウスの作製を行った。
まず、ノックインヘテロマウスにおいて、fluorescence-activated cell sorter(FACS)を用いてVenusを指標にMohawk欠損細胞と物Mohawk現細胞を単離することができるように、ノックインベクターを構築した。続いて、エレクトロポレーション法を用いてTT2Fマウス胚性幹細胞株ヘノックインベクターを導入し、G418による薬剤選択を行い、結果、105株のES細胞株を単離した。得られたES細胞株それぞれについて、まず、1stスクリーニングとして、3'相同組み替え領域の外側に設計したprobeを用いてサザン解析を行い、20細胞株のES細胞株を得た。次に、2ndスクリーニングとして、ネオマイシン遺伝子配列を認識するprobeを用いてサザン解析を行い、15細胞株のES細胞株を取得した。最後に、3rdスクリーニングとして、5'相同組み替え領域の外側に設計したプローブ用いてサザン解析を行い、最終的に8株の相同組み替え体ES細胞株を取得した。得られた相同組み替え体ES細胞株のうち、#10と#14においてマイクロインジェクション法を用いてキメラマウスの作製を行い、#10ES細胞株から100%ES細胞株由来のchimeraマウスを2匹取得し、それらのマウスのgerm line transmissionを確認した。さらに、chimeraマウスを交配させることによって得られたヘテロマウス同士をさらに交配し、ホモマウス(ノックインマウス)を取得した。今後も、引き続き研究計画書に従って研究を行い、臨床的に困難とされている腱の修復・再生の実現に向けて当該遺伝子の機能解析を行う。
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