|
(a)Zの固定化
DNA-RNAハイブリッドタイマー、dG-rUをDNA合成機上で合成した。その後、光反応と加水分解し、dZ-rUを生成させ、高速液体クロマトグラフィーでdZ-rUを精製した。単離したdZ-rUにNaIO_4処理を施し、アルデヒド基を生成させた。これにヒドラジン基を有する固相担体と反応させ、固相担体上にZ骨格を固定した。同時に、アプタマーを固相担体から剥離するためのdZの合成や、ネガティブコントロールのためのdGを固定した固相担体の合成を行った。
(b)アプタマーの構築
40塩基のランダム配列を含んだDNAライブラリー(約10^14種類)からSELEX法でアプタマーを選択した。具体的には、(i)DNAライブラリーから転写によりオリゴマープールを作製、(ii)(a)で作製した固相担体に結合させ、(iii)担体に結合したライブラリーを溶出、2本鎖DNAライブラリーに戻した。この(i)~(iii)の操作を繰り返し、Zに結合するアプタマーを選択した。なお、非特異的な結合するものを選択ライブラリーから除外するため、天然ヌクレオシドを固定化した担体と混合し、液相を回収する操作も行った。こうして、Zに特異的に結合するいくつかのアプタマーを得た。
|
