| 研究概要 |
Nocardia farcinicaのゲノム解析よりシデロフォア生合成遺伝子と推定されるnbtクラスターを見いだしており、また本菌株からシデロフォア"nocobactin"の生産を確認している。したがって、本研究ではnbtクラスターの最終産物がnocobactinであることを遺伝子解析により証明すること目的としている。
前年度の研究にて構築したnbtクラスター(nbtA-H, S, T)を導入したStreptomyces avermitilis株を利用して異種発現を試みた。HPLC を用いて代謝産物の解析を行ったが、nocobactinの生産は確認できなかった。これは、非リボソーム依存型合成酵素(NRPS)がホスホパントテン酸転移酵素によって翻訳後修飾された活性型のホロ酵素になっていないと考え、この株にnocardiaのホスホパントテン酸転移酵素遺伝子を導入した株を構築したが、同様にnocobactinの生産は確認できなかった。
nbtクラスターがnocobactin生合成遺伝子であることを証明するためのもう一つの方法として、我々のグループが開発したNocardiaの遺伝子操作系等を利用しnbt遺伝子の破壊株の作成を行った。結果、nbtAおよびnbtEの破壊株を作成することができた。相補株に関しては、Nocardia-E. coliのシャトルベクターを用いて作成した。破壊したnbtA遺伝子は、thioesteraseをコードしており、そのアミノ酸配列を用いた解析によりtype IIのthioesteraseであると予想された。nbtE遺伝子は、NRPSをコードしており、アデニル化ドメインの解析によりリジンを基質としていることが推定された。また、N末端側の縮合ドメインのアミノ酸配列中に異性化ドメインのモチーフ配列を見いだした。このことは、nocobactinのカプロラクタム環部位のリジンがD体である結果と一致することから、NbtEがこの部位の生合成に関与すること示唆された。
今後、作成した破壊株の詳細な解析等を行いnocobactinの生合成経路の解明を進める。また、生合成経路の改変により新規化合物の取得を目指す。
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