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Arsインスレーター結合因子の網羅的解析を行うため、ウニ胚からの核抽出液Arsインスレーター全長をプローブとしたゲルシフト解析を行った。その結果、Arインスレーター結合因子がDNA上に特異的な複合体を形成する条件および複合体を解離させることのできる塩濃度を決定した。
Arsインスレーターが形成するDNAの立体構造を解析するために、Arsインスレーターを含むプラスミドDNAを二次元アガロースゲル電気泳動により解析し、超らせん依存的な立体構造が形成されないことを確認した。また、直鎖状DNAおよび超らせんDNAを用いて、ジェチルピロカーボネート(DEPC ・ 塩基修飾剤)を用いたケミカルプローブ法によりDNA構造を解析したところ、Arsインスレーター中にDEPC高感受性部位が検出された。さらに、Arsインスレーターを鋳型としたプライマー伸長反応を行ったところ、DNAポリメラーゼによる合成反応が停止しやすい部位が検出された。
Arsインスレーターのクロマチン構造形成能を解析するために、リコンビナントヴニヒストンを作成してin vitroクロマチン再構成系を確立した。この再構成クロマチンを用いてArsインスレーターのヌクレアーゼ感受性を調べたところ、クロマチン構造によりヌクレアーゼ感受性を示す部分とヌクレアーゼによる切断から保護される部分が検出された。
以上の結果を総合的に解析すると、ArsインスレーターのDEPC高感受性部位・DNAポリメラーゼによる合成反応が停止しやすい部位・クロマチン構造によりヌクレアーゼ感受性を示す部位には相関がみられた。これらの結果を踏まえ、来年度は上記部位とArsインスレーター活性との関連についてさらに解析を進めたい。また、Arsインスレーター機能における結合タンパク質の役割についても検討したい。
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