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本年度は以下の研究を行った。
1.K63リンクポリユビキチン鎖とNEMOとの複合体構造の解析に適したNEMOのタンパク質飯域の探索
GST融合タンパク質としてNEMO全長と204-360領域を発現させる発現系を構築した。これらの融合タンパク質を大腸菌で発現させて精製したところ、純度の高いサンプルが得られた。NEMOは自己会合体を形成するとの報告浴あるため、精製したサンプルを使って、会合体形成能を解析中である。
2.SUMO化NEMOの構造解析に適したNEMOのタンパク質領域の探索
NEMOのSUMO化に必要と報告されているPIASyをMBP融合タンパク質として発現させる発現系を構築した。大腸菌内SUMO化システム(必要な酵素、基質などを共発現させてSUMO化タンパク質を発現させるシステム)を用いてNEMOのSUMO化を試みているが、現在までにSUMO化は確認できていない。代替法として、試験管内でSUMO化反応を行うために、NEMO-PIASy複合体の調製を現在行っている。
3.C末端ZnフィンガードメインのNMR構造解析
アミノ酸配列の解析からNEMOのC末端にZnフィンガードメインが存在すると予測されていたので、このドメインの発現系を構築した。大腸菌で発現させて、タンパク質を精製し、NMR測定を行った。構造計算に必要なデータはほぼ取り終え、現在主鎖の帰属まで終わっている。このドメインの構造解析は計画段階では記述していなかったが、この領域のアミノ酸変異により重篤な遺伝病を発症することが報告されているため、このドメインの構造解析を行いアミノ酸変異の影響を明らかにすることは重要だと思われる。
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