酵母を用いたロイコトリエンB4受容体の大量発現、精製、結晶化

2008 年度 研究成果報告書

• 研究課題/領域番号: 19770095
• 研究種目: 若手研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 構造生物化学
• 研究機関: 独立行政法人理化学研究所
• 研究代表者: 堀 哲哉 独立行政法人理化学研究所, 宮野構造生物物理研究室, 研究員 (20344054)
• 研究期間 (年度): 2007 – 2008
• キーワード: ロイコトリエンB_4 / Gタンパク質共役型受容体 / 酵母 / 大量発現 / 翻訳後修飾 / 変異体 / リガンド結合活性 / 精製

研究概要

結晶化に向けてメタノール資化酵母によるモルモット由来ロイコトリエンB_4(LTB_4)受容体(BLT1)の大量発現系構築を行った。100種類を超える変異体実験の結果、特にアミノ酸残基1-14番欠損体/Ser309リン酸化部位変異体(dN15/S309A)の^3H-LTB_4親和性は、Kd=7.6nM,Bmax=57.5pmol/mgであり、生体組織中のBLT1の親和性と同程度であった。1L培養スケールで180・gの精製サンプルを調製した。SDS-PAGEでの分子量は約40kDであるが、ゲルろ過では分子量約100kDであり、二量体で精製されていることになる。

研究成果

• [雑誌論文] Membrane protein crystallography for structure-based drug design (2009)
  • 著者名/発表者名: Miyano, M., Ago, H., and Hori, T.
  • 雑誌名: Medchem News 19 ページ: 20-31
• [雑誌論文] Crystal structure of squid rhodopsin with intracellularly extended cytoplasmic region. (2008)
  • 著者名/発表者名: Tatsuro Shimamura, Kenji Hiraki, Naoko Takahashi, Tetsuya Hori, Hideo Ago, Katsuyoshi Masuda, Koji Takio, Masaji Ishiguro and Masashi Miyano
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. 283 ページ: 17753-17756
  • 査読あり
• [雑誌論文] 脂質メディエータ合成酵素の構造と機能 ; 最近の進展 (2008)
  • 著者名/発表者名: 吾郷日出夫、堀哲哉、宮野雅司
  • 雑誌名: 分子心血管病 9 ページ: 63-70
• [雑誌論文] Helix 8 of leukotriene B4 type-2 receptor is required for the folding to pass the quality control in the endoplasmic reticulum
  • 著者名/発表者名: asuda D, Okuno T, Yokomizo T, Hori T, Hirota N, Hashidate T, Miyano M, Shimizu T, Nakamura M.
  • 雑誌名: FASEB J (in press)
  • 査読あり
• [学会発表] Leukotriene B_4 12-hydroxydehydrogenase/15-oxo-prostaglandin 13-reductase complex structure with anticonfiguration of indomethacin (2007)
  • 著者名/発表者名: 堀哲哉
  • 学会等名: 第30回日本分子生物学会年会・第80回日本生化学会大会 (BMB2007)
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2007-12-12