| 研究概要 |
本研究は、複製開始のタイミングを制御するメカニズムの解明を目指している。大腸菌の複製開始蛋白質DnaAの活性は、ヌクレオチド結合によって調節されており、ATP結合型が活性型で、ADP結合型は不活性型である。申請者は、特異的なDNA配列(DARS,DnaA-Reactivating Sequence)が、ADP結合型DnaAをATP結合型DnaAへ変換することを見出している。このDARS活性は、大腸菌の蛋白粗画分によって促進される。そのため、蛋白粗画分中に、DARS促進因子(DAF,DARS-Activating Factor)の存在が示唆される。そこで、本研究では(1)DAFの単離、同定及び機能解析、(2)DAF存在下でDnaA再活性化能を持つ染色体領域の網羅的探索、以上2項目を指針として計画を立案、遂行中である。(1)DAFの単離、同定、及び機能解析
DARS領域を用いたプルダウン法で、蛋白粗画分中からDARSと特異的に相互作用する複数の蛋白質を単離、同定した。今後、同定された蛋白質をヒスチジンタグ融合型で大量発現、精製後、精製蛋白質がDARSの活性を促進するか検討する予定である。プルダウン法と並行し、粗画分をカラムクロマトグラフィーで分画し、DAFの精製を試みている。現在、2種類のカラムを用いて、DAFの比活性が約8倍に上昇した画分を得ている。さらに精製を進め、DAFの同定を目指す。
(2)DAF存在下でDnaA再活性化能を持つ染色体領域の網羅的探索
λファージ上に大腸菌のゲノム配列断片がクローン化されたDNAライブラリーを用いて、DAF存在下でDnaA再活性化能を持つ染色体領域を網羅的に探索している。現在、既知のDARS領域をクローン化したファージDNAを用い、DnaA再活性化能を評価するためのin vitro反応系を構築中である。
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