| 研究概要 |
本研究ではアポトーシスという細胞レベルの現象がいかにして石灰化という組織レベルの現象,特に血管の石灰化に結びつくのか検討すると共に,血管の石灰化メカニズムの解明を目指すことを目的としている.平成19年度はこのアポトーシスという細胞レベルの現象を単一細胞レベルで検出するための手法の構築を目指し,必要な基盤技術の開発を行った.
通常アポトーシスの検出はDNAの断片化あるいはcaspase-3の活性を検出することで行うが,これらは生細胞での検出を目的としていない.そこで,細胞-特に正常細胞-を培養しながら単一細胞でのアポトーシスを検出する方法の開発が必要となる.生細胞内でのcaspase-3の検出を行うため,AFMとナノ針を用いた低侵襲細胞操作技術を利用した.この技術は正常な細胞内にナノ針を低侵襲に挿入することで細胞内の現象を針表面上の反応としてとらえることが出来る技術である.
caspase-3の検出と細胞操作技術を組み合わせるためにはナノ針上でaspase-3の検出システムが安定に機能するための表面処理技術を開発する必要がある.ナノ針表面での酵素反応の反応場として細胞膜上にあるフォスファチジルコリンの類似構造体ポリマーであるMPCポリマーを用いた.MPCポリマーを用いることで,細胞内でナノ針が様々な分子と非特異的な相互作用をすることを抑制し,かつ酵素反応を行うための反応場が提供されることがわかった.
また,ナノ針表面で反応するためのcaspase-3の検出系として大腸菌で合成したタンパク質にAlexa蛍光色素をin vitroで修飾した新しいFRET型のcaspase-3センサー分子を構築し,それがナノ針上で正常に機能することを見出した.
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