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今年度はRNAウイルスの感染に対して、植物のユビキチンリガーゼであるTARFがどのような機能を果たすかについて解析するために、モデルウイルスであるTMVを用いて以下の解析を行い、TARFはTMVの感染に対して阻害的に働く因子であることを示唆した。
<ウイルスベクターを用いたVIGSによるTARF発現抑制の確認>
TARFの機能を明らかにすることを目的とし、ウイルスベクターを用いて特定のmRNAを特異的に発現抑制(サイレンシング)するVIGS(virus-induced gene silencing)を試みた。Potato virus X(PVX)ベクターを用いたVIGSによりNicotiana benthamianaにおいてTARF遺伝子のサイレンシングを行い、リアルタイムPCRによりTARF遺伝子のノックダウンを確認した。その結果、顕著な植物体への影響は観察されなかった。
<TARF遺伝子サイレンシング組織におけるウイルス増殖量の比較>
VIGS法によりTARF遺伝子をサイレンシングした葉にTMVを接種し、その蓄積量をノーザンブロットにより調べた。その結果、TARFサイレンシング区では対照区に比べTMV RNA蓄積量が増加した。さらにウイルス感染を可視化する目的で緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するレポーターウイルス、TMV-GFPを接種に用いたところ、TMV-GFPによる蛍光斑の個数が対照区と比較してTARFサイレンシング区において増加した。従って、TARF遺伝子のサイレンシングによりTMVの蓄積が促進されることが示された。
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