| 研究概要 |
ピーナッツ主要アレルゲンの精密な立体構造を決定し、アレルゲン性と立体構造の関連について検討を加えるため、主要アレルゲンの一つであるAra h 1について、平成20年度に続き高品質の単結晶を得るための検討を加えた。平成20年度に得られた単結晶は分解能3.5Aにとどまったため、結晶の質を更に高めるため、立体構造形成に寄与の少ないN-末端、およびC-末端の配列を欠失させた変異型Arah1(Arah1core)の大腸菌発現系を構築した。得られた組換え型Ara h 1 coreを単一に精製し、結晶化条件の検索を行ったところ、0.1Mのクエン酸ナトリウム緩衝液(pH=5.6)中で、15%のPEG400を沈殿剤としてAra h 1 coreの単結晶を得ることに成功した。得られた結晶のX線回折データを、Spring-8放射光施設において取得したところ、2.8Åまでのデータを収集し、空間群C2、格子定数a=165.9,b=89.26, c=160.04,α=90°,β=109.046°,γ=90°と決定した。得られた回折データの初期位相を、ダイズ7Sグロブリン立体構造をサーチモデルとした分子置換法により決定し、現在、Arah1 core立体構造モデルの精密化を進めている。また、更に高分解能のデータを取得し、Arah1の立体構造とアレルゲン性の相関を精緻に解析するため、高品質のAra h 1結晶の調製を試みている。他方の主要アレルゲンであるArah3についても、大腸菌発現系による発現条件の検討を行った。その結果、Ara h 3のN-末端にマルトース結合タンパク質を融合し、大腸菌Rosetta株を発現用宿主とした条件において、組換え型Ara h 3を可溶性タンパク質として発現させることに成功した。現在、粗換え型Ara h 3の大量発現を試みており、精製条件の検討を行っている。
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