| 研究概要 |
ヒラメ食細胞の膜タンパク遺伝子を網羅的に取得するために,ヒラメ食細胞cDNAライブラリーの抗血清によるスクリーニングを行った。
膜タンパク質に対する抗血清は,市販のキットを用いてヒラメ食細胞から膜タンパクを精製し,マウスに複数回免疫することで作成した。また,食細胞をそのままラットに接種し,食細胞全タンパク質に対する抗血清も作成した。作成した抗血清は,いずれも10000倍以上に希釈してもヒラメ食細胞に反応が認められ,充分に高い力価が得られた。
大腸菌を宿主とした発現ライブラリーでは,交叉反応が多く,抗体によるスクリーニングが有効に行えなかった。そこで,レトロウイルスをベクターとした哺乳類細胞を用いた発現ライブラリーの作成を試みた。まず,ヒラメ食細胞cDNAをレトロウイルスプラスミドベクターに組み込み,3.1×10^5サイズのプラスミドライブラリーを作成した。プラスミドライブラリーをパッケージング細胞に組み込み,約1×106/mLの力価の組替えウイルスを作成した。ウイルスをマウス由来のNIH3T3細胞に感染させ,ヒラメ遺伝子をNIH3T3細胞に組み込んだ。現在までに,ウイルスを感染したNIH3T3細胞はヒラメ由来の遺伝子をゲノム上に保有していることをPCRで確認している。
今後,抗血清を用いて発現スクリーニングを行う。抗体に反応した細胞はクローニングし,インサートをシークエンスし,塩基配列を決定する。得られた塩基配列を基に既知の遺伝子との相同性を調べるとともに,ヒラメ白血球における発現解析を行う。
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