研究概要 |
本研究では、ALアミロイドーシスの原因タンパク質である免疫グロブリンL鎖可変領域ドメイン(V_L)について、アミロイドーシス発症の分子的メカニズムの解明を目指している。アミロシドーシス患者由来VLについてNMRによる物理学的手法から、その変性状態での動的構造を明らかにし、さらに変性構造に関わるアミノ酸変異による変性構造変化とアミロイド線維形成の影響を調べ、両者の関連性を証明する。それらの情報を元に、アミロイド線維阻害方法の開発に着手することを目的としている。 1)V_Lの発現系の構築と調製 報告されている遺伝子配列からプライマーをデザインしPCRによりALアミロイドーシスのnatural mutantであるWi1とJto及びその野生型にあたるλ6配列(Wild-type)のV_Lの3種の全合成を行った。その後、大腸菌発現ベクターに組み込み、大腸菌により大量培養をおこなった。種々の培養条件検討の結果、3種共に可溶性として大量に発現させることに成功した。また陰イオン交換、陽イオン交換の両クロマトにより、高純度に精製することが出来た。その後、V_Lが持つ2つのシステイン残基を変性剤に溶解しアルキル化することで、変性タンパク質の調製も行った。また、NMR解析を行うため、^<15>Nラベル体、^<13>C^<15>Nダブル標識体も同様に行い、解析できる程の調製に3種とも成功した。 2)NMR解析 大腸菌より精製した還元アルキル化V_Lの^<15>Nラベル体を用いて、HSQCスペクトル解析による最適な条件検討を行った結果、0.1mMHCLpH2,20℃の条件で良好なスペクトルが得られた。さらに^<13>C^<15>Nダブル標識体についてNMRによるHSQCスペクトル解析を行った。2DNMR解析としてHSQC測定をおこない、3D NMR解析としてHNCA、HNCOCA、HNCACB、CACBCONH測定を行った。その後還元アルキル化Wild・typeについて全アミノ酸(Proを除く)を帰属することに成功した。さらに還元アルキル化Wild・typeの^<15>Nラベル体の緩和解析を行ったところ、変性状態において3つのクラスターを形成していることが明らかとなった。現在、WilとJtoについて帰属中である。
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