| 研究概要 |
本研究の目的は,正常の心臓において観察される交感神経刺激による心筋細胞のL型Ca^<2+>電流増大現象にRadが関与することを明らかにすることであり,本年度は「再構成系の構築」及び「再構成系を用いた電流の検討」を行った。具体的には,「再構成系の構築」の為に必要な遺伝子のうち,心筋のL型Ca(2+)チャネルの責任遺伝子であるα_(1c)subunit・β_(2c)subunit・α_2δsubunitとRadはクローニング済みのため,AKAP5/18をまずクローニングした。次に,導入する遺伝子が多くなるため,(1)α_(1c)とα_2δはBHK細胞に恒常的に発現させ(stable-celllineの作製),(2)β_(2c)とAKAP15/18をpIRES vectorにサブクローニングし,(3)pIRES2-DsRed-Express vectorにRadをサブクローニングした。
次いで,「再構成系を用いた電流の検討」を行った。具体的には,パッチクランプ法を用い,上記で作製した再構成系で観察されるL型Ca^(2+)電流のforskolin投与に対する反応性を観察した。我々の当初の仮説通りであればforskolin投与により,L型Ca^(2+)電流の増大が観察される予定であったが,実験結果としては,電流の増大は観察することができなかった。
以上の結果より,交感神経刺激によるL型Ca^(2+)電流の増大を再構成系で再現するためには,我々が細胞に導入したものの他に,別の遺伝子が必要であることが判明した。今後,Radが交感神経刺激によるL型Ca^(2+)電流増大に関与していることを証明するため,当初の予定通り,nativeの心筋細胞で発現しているRadをsiRNAによってノックダウンした一次培養心筋細胞を用いた研究を行う予定である。
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