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1. rIR-FLAG分泌タンパクの作成
BHK細胞株に遺伝子導入したrIR-FLAGの分泌タンパクを得ることが出来たため、これを培養し、上清を100倍に濃縮した。しかし、100倍濃縮後でも、rIR-FLAGの濃度は0.1mg/ml程度であった。BaitとしてのrIR-FLAGは1mg/ml以上必要であることが判明したため、rIR-FLAGのplasmid vectorを組み込んだ組み換えウイルスを作製し、カイコ幼虫に感染させてその体液から大量にrIR-FLAGを回収するという方法を試みた。感染カイコ幼虫の体液中で、rIR-FLAGのmRNAレベルの発現は確認できたが、タンパクの発現には至らなかったため、は1mg/ml以上のrIR-FLAGを得ることは出来なかった。
2. タンパク質間相互作用分析
インスリンとrIR-FLAGとのタンパク質間相互作用分析の予備実験を、アフィニティークロマトグラフィー、Far-Westernプロット法、Pull-down法を用いて行った。アフィニティークロマトグラフィー、Far-Westernプロット法ではインスリンの確認は不可であった。抗FLAG M2 affinity beadsを用いてインスリンとrIR-FLAGをpull-downしたところ、最終産物におけるインスリンの確認が、インスリンが高濃度である際には成功することもあったが、再現性のある結果は得られなかった。予備実験の結果を踏まえて、当該患者血清を使用してのタンパク質間相互作用分析にまでは至っていない。
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