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マウス由来の培養細胞を用いHIF-1αタンパク質の低酸素による時間依存的安定化をウエスタンブロット法により確認した。また、これまでHIF-1αを安定化することが知られているFeキレート剤やCoCl_2でも同様にHIF-1αタンパク質が時間依存的に安定化されることを確認しだ。さらに、 HIF-1αを特異的にノックダウンすることが可能なsiRNAを合成し、 amaxa biosystem社のNucleofectorを用いてtransfection後、ウエスタンブロット法を用いてその効率を検討した。最もノックダウン効率の良かったsiRNAの配列をもとにプラスミドによるsiRNA発現系を構築中である。このsiRNA発現系が構築でき次第、そのsiRNAのcharacterizationを行う(HIF-1αmRNAのノックダウン、 HIF-1αタンパク発現の抑制、標的遺伝子発現の抑制など)。また、HIF-1標的遺伝子の発現を定量的に検討するため、 Real-time PCRシステムを導入し、VEGF、 TGRβ、 PAI-1などのHIF-1標的遺伝子発現の検討を行っている。さらに、構成的活性型HIF-1αとドミナント・ネガティブHIF-1αがマウス由来の細胞でも機能することをプラスミド発現系で確認した。現在、HIF-1αをノックダウンするsiRNA、構成的活性型HIF-1α、およびドミナント・ネガティブHIF-1αのアデノウイルスを用いた発現系を構築中であるが、HIF-1標的遺伝子の誘導効率あるいは抑制効率が低いため問題点を検討中である。アデノウイルスを用いた発現系の問題点解決と並行し関節リウマチのモデルであるアジュバント誘導関節炎モデルマウスの作成を行っている。モデルマウスの作成後、関節リウマチにおける低酸素応答性遺伝子発現、HIF-1による遺伝子発現調節の意義について検討する予定である
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