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1 PO-Cre/Rosa26Rマウス(神経堤由来細胞が特異的に発現するマウス)の作成
神経堤細胞に特異的に発現するprotein O (PO) promoter下にCreを付けた遺伝子を発現するマウスとLoxP-LacZを発現するマウスを掛け合わせる事により作成した。
2 新生児eGFP発現マウス由来骨髄の野生型新生児マウスへの生下時骨髄移植モデルの作成
野生型妊娠マウスに骨髄抑制剤ブスルファン皮下注により胎児骨髄抑制を行い、生後0日に緑色蛍光色素であるレポーター遺伝子enhanced green fluorescent protein(eGFP)を組み込むことにより全身の細胞が緑に発色するeGFP陽性マウスの骨髄細胞を大腿骨、脛骨より採取し腹腔内投与により、モデルマウスを作成した。
3 肺高血圧の作成と病変の評価
生後7週から0.5気圧の低気圧チャンバーで飼育し、21日後にマウスを屠殺した。神経堤細胞特異的なPO発現を、組織染色とフローサイトメトリーで、PO発現を確認した。
4 骨髄由来細胞の肺血管床での取り込みの評価
共焦点顕微鏡にて各種血管構成細胞陽性細胞中EGFP陽性細胞の取込みを確認した。
5 各種免疫染色法による解析
血管平滑筋マーカー(αアクチン陽性)、線維芽細胞マーカー(vimentin陽性かつCD31陰性)、壁細胞マーカー(chondroitin sulfate proteoglycan 4(NG2)陽性)を用いて骨髄由来細胞の割り合いを評価した。一部の肺血管病変における平滑筋細胞は神経堤由来で骨髄由来のものは認めなかった。内皮細胞は、骨髄由来のものは認めるが神経堤由来のものは認めなかった。
以上を、さらに数を増やし、定量的解析を進めている。
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