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Double ligand PEG-リポソームの調製は、次の6工程を経て行った。
1.DSPE/CHを構成脂質とし、必要とする薬物を封入したリポソームをREV法で調製
2.マレイミド基をPEG末端に有するMAL-PEG-DSPE、またはサクシニル基を有するSUC-PEG-DSPEを用いPh7.0またはpH7.4のHEPES緩働液中でミセルを形成
3.二種類のligandを別々にふ2で調製したミセルに添加し、25℃で1hインキュベート
4.Ligand結合ミセルとリポソームを4℃、over nightで攪拌下インキュベート
5.4でligandを包埋したリポソームにリガンドを結合させていないPEG-DSPEのミセルを添加し、4℃、over nightで攪拌下インキュベート
6.超遠心により、リポソームに包埋されなかったミセルを除去
適宜蛍光ラベルした各ligandのリポソームへの導入効率は、4-35%であり、2種類のリガンドをつけることによって、大きな導入効率の低下は見られなかった。一方で、反応条件によって大きく導入効率が変化する傾向がみられたので、構成脂質・温度などについて、きらなる検討が必要であると思われる。
Ligandとして、bradykininB1アゴニストである合成ペプチドとラミニンフラグメントに相当する合成ペプチドを用いた場合、予備実験として行ったU251細胞と共培養したHUVECでの透過実験では、PEG-リポソームに対して、24hで1.8-4.3倍の透過効率が得られた。しかし、透過効率は1%前後と行う予定であるin vivoでの脳移行実験において、十分な透過効率でない可能性がある。
今後、HUVECではなく、BBBモデルとしてより有用なBBBキット^<TM>(ファーマコセル株式会社)を用いて、詳細な検討を行う予定である。
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