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今年度は、時期組織特異的遺伝子破壊に用いるfloxed SEK1遺伝子改変マウスの作成を試みた。具体的には、E14K ES細胞をフィーダー細胞非存在下にて純粋培養し、1290laゲノムDNAを抽出、PCR法を用いてSEK1/MKK4遺伝子断片を取得した。取得したSEK1/MKK4遺伝子断片に、loxP配列・ネオマイシン耐性遺伝子を組み込み、ネガティブ選択マーカーとしてDTA遺伝子を加え、floxed SEK1/MKK4遺伝子ターゲティングベクターを構築した。構築したベクターをE14K ES細胞にエレクトロポレーション法を用いて遺伝子導入し、G418存在下で1週間に渡って培養、G418耐性コロニーを得た。各々のコロニーからゲノムDNAを抽出し、PCR法・サザンブロッティング法にて相同組換え体ESクローンを同定した。各クローンをC57BL/6の胚盤胞ヘインジェクション法により導入、floxed SEK1/MKK4キメラマウスを得た。現在、生殖細胞系への移行を確認するため野生型マウスとの交配を行っている。
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