| 研究概要 |
今年度は、主にH9c2心筋芽細胞を用いて、変異解析を用いたAktのシステインSH基の酸化還元状態とリン酸化制御についての解析を行なった。まず、既に作成済みであったAktの297番目および311番目のシステインをセリンに置換したAkt mutant発現ベクター(cAkt-C297S,cAkt-C311S, cAkt-C297, 311S)を実験に使えるように大量に精製した。C297およびC311はAktのリン酸化部位に近接しており、Aktタンパクに複数存在するシステインのなかでも特に重要であると考えられることから、この部位を中心に解析を進めるためである。次に精製した変異発現ベクターをH9c2心筋芽細胞に一過性に発現させた。遺伝子導入にはLipofectAMINE PLUSを用いる予定であったが、時間短縮や遺伝子導入効率の改善が見込めることからLipofectAMINE 2000へ変更した。この試薬を用いた際の最適な条件を見出すために時間を要した。あらかじめ変異Aktを一過性発現させたH9c2心筋芽細胞を準備し、遺伝子導入48時間後に過酸化水素の投与を行なった。過酸化水素投与によるAktリン酸化の誘導は、これまでの研究結果から100μMで行なった。長時間の刺激では細胞障害の程度が強すぎるため、刺激時間は30分とした。免疫沈降法により回収した変異Aktを用いて、Western blot法により変異Aktのリン酸化の状態について検討した。まずは、cAkt-C297,311Sの酸化ストレス下でのリン酸化状態の解析を中心に行っており、今後cAkt-C297SやcAkt-C311Sについても同様の解析を行なう。
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