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これまでのAeromonas属細菌に対する研究は、重症化する仕組みに関しては検討されていない。病原細菌は様々な物質を産生、分泌しているが、そのひとつであるヒアルロニダーゼがAeromonas属細菌感染症の重症化に関与していると考え、生化学的な分離、精製と遺伝子配列の決定さらに動物モデルの作製を行い重症化の機序を明らかにしたいと考えた。
クローニング : 平成19年度と同様の方法で、目的のDNAを含む大腸菌をスクリーニング培地を用いてピックアップする。
遺伝子配列の決定 : クローニングして得られたFosmid Libraryを用いてヒアルロニダーゼをコードする遺伝子配列を決定した。スクリーニング培地で陽性を示すホスト大腸菌からクローンDNAを抽出し、目的の病原物質の遺伝子配列をランダムショットガン法を用いてDNAシークエンスを行った。目的のヒアルロニダーゼ遺伝子は他の関連遺伝子とともに、genomic islandを形成し水平伝播したと考えられた
遺伝子のノックアウト : ヒアルロニダーゼ遺伝子を持つクローンからプラスミドを取り出す。これを抗生物質抵抗性遺伝子を持ち、シュクロース存在下では菌が増殖しないpABB-CR2プラスミドに連結し、ベクターとする。そして形質転換率の高いSM10λpir大腸菌にトランスフォームする。さらにこの大腸菌をヒアルロニダーゼ活性を持つAeromonas属細菌と接合させ、相同遺伝子組み替えを起こすことで、ノックアウト株を作製する。
現在、ノックアウト株を作製中であり、動物実験モデルへ発展させる予定である。
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