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siRNA発現Vectorのラットへの遺伝子導入による心筋虚血障害治療への応用(In Vivo系)ラットは週齢8-10week (250-300g) のSprague-Dawley Ratを用いた。
(siRNA発現Vectorの作製)
Vitroの実験系において心筋細胞障害に抑制効果のあったp38 MAP Kinase遺伝子をターゲットにしたsiRNA発現ベクターを作成した。
(siRNA発現プラスミドDNAのマウスへの投与)
HVJ Envelope Vectorを用いる場合は懸濁液を1-2AU、ラット尾静脈より全身投与および、虚血予想領域の局所注入を試みた。また、多核白血球をノックダウンする場合は、Ex Vivoにて、Nucleofection法で予め遺伝子抑制した多核白血球を、白血球抗体投与により多核白血球成分が殆ど無くなる様に前処理したラットの尾静脈より全身注入した。
(RNAi効果の評価) Vector投与48-72時間後にラット心筋及び血液を採取し、目的の遺伝子の発現が抑制されている事をリアルタイムPCRによりmRNAレベルにて、蛍光顕微鏡又はDNA-binding ELISA(Active Motif社)等により蛋白レベルにて発現が抑制されている事を確認した。
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