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昆虫においで胚発生時に卵巣由来のユクジステロイ・ドが重要な役割を果たす。カイコにおいて卵巣のエクジステロイドはエクジステロイドリン酸化酵素(EcKinase)により不活性なリン酸型として蓄積し、発生時に卵に移行したりン酸型エクジステロイドがエクジステロイドリン酸脱リン酸化酵素(EPPase)により活性化され胚発生にはたらく。本研究はこの機構の更なる解析を目的としている。
1.発育中の卵巣でエクジステロイド合成酵素(シトクロムP450酵素)およびEcKinaseのmRNAを逆転写PCRとレーザーマイクロダイセクションを組み合わせ検出した。その結果、エクジステロイド合成酵素は濾胞細胞に局在していた。また、EcKinaseのmRNAは栄養細胞と卵母細胞に検出された。EcKinaseの発現をNorthern Blot、免疫染色を用いてさらに解析を行い、栄養細胞で合成されたmRNAは卵母細胞に輸送されタンパク質に翻訳されること、卵母細胞自体でEcKinaseのmRNA合成が行われている事を明らかにした。結果は論文1件、学会発表1件として発表。論文を1件投稿中である。
2.休眠卵を低温によって休眠覚醒させた時のEPPaseおよびエクジステロイド合成系の酵素の発現の変化、また、卵内のエクジステロイド含量の変化を解析する。本年度は測定するカイコ卵の収集を行った。またエクジステロイド含量の測定に必要な酵素免疫測定法を構築した。今後、収集した卵に対する解析を行う。
3.バキュロウイルスとSf9細胞を用いて組み替えEcKinase発現系を構築し、立体構造解析に必要な量の精製EcKinaseを得る。本年度は、組み換えEcKinase発現系の構築を行った。今後、組換えタンパク質がEcKinaseとして機能する事を確認し、精製、X線結晶構造解析を行う。
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