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本研究の目的は、生細胞内における特定の内在性mRNA発現量を計測することにより、その動態をリアルタイムに追跡することである。内在性mRNAの標識には蛍光性アンチセンスプローブを用い、生きた細胞内に導入したプローブと標的mRNAとのハイブリダイゼーションのカイネティクスを定量的に解析することにより標的mRNAの濃度が求まると考えた。今年度は、蛍光相関分光法(FCS)を用いて、生きた細胞内に導入したアンチセンスプローブの拡散の速さについて詳細な解析を行った。生きたCOS-7細胞に蛍光標識アンチセンスプローブをマイクロインジェクションにより導入し、細胞に内在するc-fos mRNAとハイブリダイズさせた後に、細胞質においてFCS測定を行った。FCSによる解析の結果、アンチセンスプローブは細胞内において、異なる拡散時間を有する2成分として存在した。2成分の由来は、mRNAとの結合型及び解離型であると考えられた。実際、mRNAと結合しないセンスプローブは同条件において、早い拡散時間の成分のみであったことから、アンチセンスプローブは標的mRNAと結合していることが確認された。さらに、種々の濃度のアンチセンスプローブを導入して同様の実験を行い、細胞内に導入したプローブの濃度に対する結合型濃度をプロットした。これに対してフィッティングすることにより、c-fos mRNAとアンチセンスプローブとの結合反応の解離乗数(Kd)を算出した。個々の細胞内におけるアンチセンスプローブとc-fos mRNAとの結合型・解離型濃度の比と、上記に決定したアンチセスプローブの結合解離定数(Kd)から、個々のCOS-7細胞に発現しているc-fos mRNAの濃度を求めたところ、99.2から752nMの範囲でばらついており、その平均は274nM±123nM(178細胞)であった。
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