| 研究概要 |
本年度は申請時の研究計画に則して、ウサギの角膜上皮幹細胞をカルチャーインサート型の温度応答性培養皿上で作製し、回収可能な培養角膜上皮シートを作製する研究を行った。フィーダー細胞は用いずに、培地は市販の表皮培養用培地を基本培地として使用し、ヒトリコンビナントbFGF等の細胞増殖因子を添加した。回収したシートはヘマトキシリンエオジン染色や角膜上皮特異的マーカーであるケラチン3,12の免疫染色、また角化マーカーであるケラチン1、10の免疫染色も行った。結果は、これまでの同等の方法のみでは、シートの重層化の促進が弱く、低温処理を行ってもうまくシート状に回収できず、この問題点をまず解決すべき課題であると考えた。
そこで、重層化を促進させるためこれまでに報告のあるエアリフト法を用いたり、培地のカルシウム濃度を上げてみた。すると、ヘマトキシリンエオジン染色での組織学的評価でも重層化の促進が確認され、低温処理による培養角膜上皮シートの回収が容易に行えるようになった。免疫染色にてもケラチン3,12の発現が確認できた。
しかしながら次の問題点として、回収できた培養角膜上皮シートの表層は、ヘマトキシリンエオジン染色による組織学的な所見、あるいはケラチン1、10による免疫染色にて陽性であったことから考えても、角化していることが分かった。本年度の結果からは、無血清・フィーダー細胞なしで回収可能な培養角膜上皮シートの作製・回収が可能であることを示しており、温度応答性培養皿を用いた培養角膜上皮シート移植がすでに臨床応用されていることを考えると、異種動物由来材料を用いないシート作製が可能であることを示しており非常に重要な発見である。
角化するという問題は、移植後に角膜組織へと変化して角化していることが問題にならない可能性もあるが、次年度にて検討を行う予定である。
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