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【研究目的】CRISPR/Cas9法によって、DNA切断酵素Cas9のmRNAもしくはCas9タンパク質と、標的配列に結合するgRNAを受精卵に微量注入するだけで、遺伝子ノックアウトや遺伝子ノックインを行うことができる。ゼブラフィッシュにおいて、CRISPR/Cas9法による遺伝子ノックアウトの効率は非常に高い。しかし一方で遺伝子ノックインの効率が低いことが問題となっている。本研究はこの問題を解決するために、遺伝子ノックインの最適化を検討し、効率の向上を目指した。
【研究方法】本研究では、研究代表者の所属研究所がバイオリソースとして保有するトランスジェニックゼブラフィッシュを用いて、任意のゲノム上のDNA配列へ任意の遺伝子を導入することを計画し、効率的なノックインを可能にする条件を検討した。実際の実験では、視覚化が容易なドナーDNAとして赤色蛍光タンパク質mScarlet遺伝子を利用した。
【研究成果】1日齢胚の脳でGFPを発現する系統(HGn12C)の受精卵に、標的配列に相補的なgRNA、mScarlet遺伝子を含むドナープラスミド、ドナープラスミドを切り出すためのgRNA、Cas9 mRNAを微量注入した。Cas9 mRNAとgRNAの最適量の検討、Cas9タンパク質の使用、複数のgRNAの検討を行ったが、いずれの場合も標的配列へのmScarlet遺伝子の挿入は認められなかった。注入胚からゲノムDNAを抽出し、ヘテロ二本鎖移動度解析を実施したところ、標的配列の切断効率が低いことが原因であると考えられた。そのため、標的配列を変更し、切断効率が高いgRNAを選定するとともに、ゲノムと相同性をもつDNA配列をドナープラスミドに付加する等、引き続き遺伝子ノックインの最適化を検討している。
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