Ca2+センサーのAAVベクターでの共発現と最適化

2019 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 19H00438
• 研究代表者: 岡村 理子 東京大学, 医学系研究科, 技術専門職員
• 研究期間 (年度): 2019
• キーワード: アデノ随伴ウイルス / カルシウムセンサー

研究実績の概要

○研究目的 : 本研究では、アデノ随伴ウイルス(AAV : adeno-associated virus)ベクターを用い、特定神経細胞で発現する各色のCa2+センサーを作製し、複数色のCa2+センサーを同一領域に発現させる系を開発することを目的とする。
○研究方法、結果 :
1. 同一領域に、同一血清型のAAVを複数種導入しても、細胞の同一血清型に対する受容体数に限りがあるため、高タイターでの感染を試みても、発現量が期待されるほどは得られなかった。そこで多種の血清型のCa2+センサーを作製を試みた。これまで確立したSf9細胞で作製する系を複数の血清型に適用し、各血清型AAVベクターに必要なコンポーネントを発現させるバキュロウイルス、およびCa2+センサー遺伝子をもつバキュロウイルスを作製し、共感染させることにより、異なる血清型のAAVベクターを作製した。引き続き、各血清型における①精製方法、②二つのバキュロウイルスの感染割合について検討し、高い力価ウイルスを作製するための最適化を試みた。またSf9細胞システムに平行して、HEK293細胞システムの作製法でも、各血清型の精製方法を検討した。さらに、特定神経細胞での発現を可能にするため、興奮性神経細胞特異的プロモーターや誘導調節可能な構造を持つベクターの構築を試みた。
2. トランスジェニックマウスと子宮内電気穿孔法を組み合わせ、作製したCa2+センサー発現AAVベクターをマウス脳にインジェクションすることによって、複数色のCa2+センサーを発現させることに成功した。
これら成果の一部を活用し、Ca2+センサーのin vivo脳発現に実用化した(Inoue et al. Cell 2019)。

研究成果

• [雑誌論文] Rational Engineering of XCaMPs, a Multicolor GECI Suite for In Vivo Imaging of Complex Brain Circuit Dynamics. (2019)
  • 著者名/発表者名: Inoue M, Takeuchi A, Manita S, Horigane SI, Sakamoto M, Kawakami R, Yamaguchi K, Otomo K, Yokoyama H, Kim R, Yokoyama T, Takemoto-Kimura S, Abe M, Okamura M, Kondo Y, Quirin S, Ramakrishnan C, Imamura T, Sakimura K, Nemoto T, Kano M, Fujii H, Deisseroth K, Kitamura K, Bito H.
  • 雑誌名: Cell 巻: 177 ページ: 1346-1360
  • DOI: 10.1016/j.cell.2019.04.007
  • 査読あり