| 研究課題/領域番号 |
19H00900
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
小澤 岳昌 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 教授 (40302806)
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| 研究分担者 |
尾崎 倫孝 北海道大学, 保健科学研究院, 教授 (80256510)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | RNA / テロメア / 発光イメージング |
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| 研究実績の概要 |
「光活性化型酵素を用いたIn vivo標準添加法の開発」では、PI-Lucの大量合成と精製に関する条件検討を行ってきた。T7 Express lysY/Iq Competent E. coli (High Efficiency)及びpColdI発現ベクターを用い、かつタンパク質のフォールディングを助けるためのシャペロンタンパク質の共発現を試みた結果、可溶性画分における目的タンパク質の量を著しく増やすことができた。可溶性画分で取れたPI-Lucを、pColdIペクターによりN末端に融合された6ｘヒスチジンタグを用いて、アフィニティークロマトグラフィーにより精製を試みている。ゲルろ過クロマトグラフィーによる分画を行い、純粋な全長PI-Lucを得ることができる見込みである。
「光活性化型酵素を用いたIn vivo標準添加法の開発」では、PI-Lucの大量合成と精製に関する条件検討を行ってきた。T7 Express lysY/Iq Competent E. coli (High Efficiency)及びpColdI発現ベクターを用い、かつタンパク質のフォールディングを助けるためのシャペロンタンパク質の共発現を試みた結果、可溶性画分における目的タンパク質の量を著しく増やすことができた。可溶性画分で取れたPI-Lucを、pColdIペクターによりN末端に融合された6ｘヒスチジンタグを用いて、アフィニティークロマトグラフィーによる精製及びゲルろ過クロマトグラフィーによる分画を行い、純粋な全長PI-Lucを得ることができた。更に発現及び精製規模を拡大し、大量のPI-Luc精製を行い、得られたPI-Lucの安定性を評価している。同時に、精製より得たPI-Lucと動物細胞内で発現されているPI-Lucが類似的な光刺激特性を有しているかを検証中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
「生細胞内RNAの分子数および得意配列反復回数計測技術の開発」では、今後の汎用化に向けてmPUM単位リピート構造ライブラリを作成した。ここのmPUM単位リピートライブラリを作成したことでmPUM作成の迅速化が期待でき、今後の研究の進展が大きく進むことが期待できる。またTERRA検出発光プローブにおいては、試験管内でTERRAの発光検出に成功した。本プローブを培養細胞に導入し、24時間を超える発光顕微鏡観察を行うことで、現在RNA生物学で議論の対象となっているTERRAの細胞周期に依存した局在と増減の解析法を確立できると期待できる。
「光活性化型酵素を用いたIn vivo標準添加法の開発」では、無細胞実験による標準添加法の原理検証及び細胞内発現系による標準添加法の実証に向けて、PI-Lucの大量合成及び精製条件を検討した。大腸菌とpColdI発現ベクターを用いた発現系をベースに、DnaK-DnaJ-GrpEとGroES-GroELの二種類のシャペロンを共発現することにより、可溶性画分において十分なPI-Lucを得られることができた。6ｘヒスチジンタグを用いたアフィニティークロマトグラフィー及びゲルろ過クロマトグラフィーにより可溶性画分からPI-Lucを精製することができた。たんぱく質の発現及び精製の規模を拡大することにより大量のPI-Lucを得た。精製より得られたPI-Lucの保存条件及び長期保存時の安定性を評価すると同時に、精製直後のPI-Lucを用いて光刺激特性を検証している。
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| 今後の研究の推進方策 |
前年度に開発したTERRA発光プローブを用い、生細胞内におけるTERRAの局在と発現量の変化を経時的に可視化追跡する。またTERRA関連タンパク質を蛍光標識したものを同時に試料細胞に発現し、TERRAの局在や存在量と関連タンパク質との共局在について解析する。これらの開発を通じ、細胞周期依存的なTERRAの生細胞内分析法を確立する。
3次元観察顕微鏡の構築では、前年度までに作成した検出光学系のレンズアレイの各レンズに厚さの異なる位相物質を配置し、サンプルの異なる深さ位置の像がイメージセンサー上に構築されるようにする。並行してホログラフィーを用いた3次元観察系の構築も検討し、多面的な手法から発光3次元観察法の確立を目指す。
引き続き、PI-Lucの保存条件及び長期保存における安定性を評価しつつ、精製直後のPI-Lucを用いて、動物細胞より発現したPI-Lucと同様の光刺激特性を有しているかを検証する。先ずは光照射条件の検討を行い、不活性PI-Lucの活性回復速度に影響する溶液ｐHの最適化を行う。確定した最適条件下において、規定光量の照射に伴うルシフェラーゼ不活性の割合を定量的に評価する。次に、細胞実験による標準添加法の原理検証を行たのち、細胞内発現系による標準添加法の検証を行う。
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