ヒト膜タンパク質を標的とした中分子構造創薬研究の基盤構築

2020 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 19H00923
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 岩田 想 京都大学, 医学研究科, 教授 (60452330)
• 研究分担者: 野村 紀通 京都大学, 医学研究科, 准教授 (10314246)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2024-03-31
• キーワード: 膜タンパク質 / 創薬ターゲット / 中分子ペプチド / ファージディスプレイ / X線結晶構造解析 / クライオ電子顕微鏡単粒子解析

研究実績の概要

がん、高血圧、慢性炎症など種々の疾病に対する医薬品の分子標的の多くは膜タンパク質である。その構造解析の難度は依然として高いため、現時点で構造べースの創薬研究の進展は限定的である。これまで申請者は膜タンパク質に抗体フラグメントを結合させて結晶化を促進するという独自技術を開発し、X線結晶構造解析を推進してきた。本研究では、膜タンパク質の機能を制御する中分子アプタマーの創出とその構造学的検証に有用な新しい方法論の確立を目指している。
本年度は立体的束縛を有する安定なペプチド分子骨格 (50-90残基) を基盤として複数の末端ループの配列と長さを多様化した合成ライブラリーを作製した。 具体的には分子内に多数のジスルフィド結合が架橋され強い立体的束縛のある安定な中分子ペプチド骨格をベースとして、その末端ループの配列と長さを多様化した中分子母集団を人工合成し、ファージディスプレイ系ライブラリーを作製した。病原ウイルス感染のエントリーレセプターとして機能するヒト膜タンパク質Aやがんの転移能獲得・悪性化進展に関与するヒト膜タンパク質B等の複数の創薬標的膜タンパク質について，(1) 界面活性剤ミセルに覆われた状態の精製試料，(2)脂質ナノディスクに再構成した状態の試料等を作り、さらにパニングにおいて独自技術を導入することによって、これらの膜タンパク質ターゲットに対して特異的に認識し結合するファージ集団を4-12サイクル程度の選抜を経て取得した。選抜過程でのファージ集団の優占度の遷移をシーケンス解析にて評価した。
膜タンパク質/中分子ペプチド複合体を精製し、それを抗原として用いて結晶化促進ツールとしての構造認識抗体を作製した。Fab抗体断片の添加により、 膜タンパク質/中分子ペプチド/Fabの三者複合体の精製品を調製し、クライオ電子顕微鏡単粒子解析の予備検討を進めた。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

立体的束縛を有する安定なペプチド分子骨格 (50-90残基) を基盤として複数の末端ループの配列と長さを多様化した合成ライブラリーを実際に作製して、異なる複数の膜タンパク質ターゲットに対して中分子バインダーを取得し、それらについてクライオ電子顕微鏡単粒子解析法により結合様式を明らかにするための実験に進んでいるので、本年度の目標は概ね達成できていると自己評価した。

今後の研究の推進方策

膜タンパク質/中分子ペプチド複合体を精製し、それを抗原として用いて結晶化促進ツールとしての構造認識抗体を作製する。Fab抗体断片の添加により、 膜タンパク質/中分子ペプチド/Fabの三者複合体の精製品を調製し、この試料を用いてクライオ電子顕微鏡単粒子解析による構造解析を実施する。これと並行して、当該複合体試料を用いて脂質キュービック相結晶化法により結晶を作製後、放射光マイクロフォーカス ビームにより回折データを収集する。膜タンパク質/中分子ペプチド/Fab複合体の立体構造(分解能2.5-3Å)を決定する。中分子ペプチドのファーマコフォア同定を経て、作用機序の構造学的基盤を解明する。

研究成果

• [国際共同研究] University of California, San Francisco(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: University of California, San Francisco
• [国際共同研究] Fudan University(中国)
  • 国名: 中国
  • 外国機関名: Fudan University
• [雑誌論文] Cryo-EM Structure of the Prostaglandin E Receptor EP4 Coupled to G Protein (2021)
  • 著者名/発表者名: Nojima Shingo、Fujita Yoko、Kimura Kanako Terakado、Nomura Norimichi、Suno Ryoji、Morimoto Kazushi、Yamamoto Masaki、Noda Takeshi、Iwata So、Shigematsu Hideki、Kobayashi Takuya
  • 雑誌名: Structure 巻: 29 ページ: 252～260
  • DOI: 10.1016/j.str.2020.11.007
  • 査読あり
• [雑誌論文] S1PR3?G12-biased agonist ALESIA targets cancer metabolism and promotes glucose starvation (2021)
  • 著者名/発表者名: Toyomoto Masayasu、Inoue Asuka、Iida Kei、Denawa Masatsugu、Kii Isao、Ngako Kadji Francois Marie、Kishi Takayuki、Im Dohyun、Shimamura Tatsuro、Onogi Hiroshi、Yoshida Suguru、Iwata So、Aoki Junken、Hosoya Takamitsu、Hagiwara Masatoshi
  • 雑誌名: Cell Chemical Biology 巻: 未定 ページ: 未定
  • DOI: 10.1016/j.chembiol.2021.01.004
  • 査読あり
• [雑誌論文] High-resolution crystal structures of transient intermediates in the phytochrome photocycle (2021)
  • 著者名/発表者名: Carrillo Melissa et al.
  • 雑誌名: Structure 巻: 未定 ページ: 未定
  • DOI: 10.1016/j.str.2021.03.004
  • 査読あり
• [雑誌論文] Time-resolved serial femtosecond crystallography reveals early structural changes in channelrhodopsin (2021)
  • 著者名/発表者名: Oda Kazumasa、et al.
  • 雑誌名: eLife 巻: 10 ページ: e62389
  • DOI: 10.7554/eLife.62389
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Endogenous agonist-bound S1PR3 structure reveals determinants of G protein-subtype bias (2021)
  • 著者名/発表者名: Maeda S, Shiimura Y, Asada H, Hirata K, Luo F, Nango E, Tanaka N, Toyomoto M, Inoue A, Aoki J, *Iwata S and *Hagiwara M.
  • 雑誌名: Science Advances 巻: 未定 ページ: 未定
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The structure of MgtE in the absence of magnesium provides new insights into channel gating. (2021)
  • 著者名/発表者名: Jin F, Sun M, Fujii T, Yamada Y, Wang J, Maturana AD, Wada M, Su S, Ma J, Takeda H, Kusakizako T, Tomita A, Nakada-Nakura Y, Liu K, Uemura T, Nomura Y, Nomura N, Ito K, Nureki O, Namba K, Iwata S, Yu Y, Hattori M.
  • 雑誌名: PLoS Biology 巻: 19 ページ: e3001232
  • DOI: 10.1371/journal.pbio.3001231
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Comparing serial X-ray crystallography and microcrystal electron diffraction (MicroED) as methods for routine structure determination from small macromolecular crystals (2020)
  • 著者名/発表者名: Wolff Alexander M.、et al.
  • 雑誌名: IUCrJ 巻: 7 ページ: 306～323
  • DOI: 10.1107/S205225252000072X
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] The primary structural photoresponse of phytochrome proteins captured by a femtosecond X-ray laser (2020)
  • 著者名/発表者名: Claesson Elin、et al.
  • 雑誌名: eLife 巻: 9 ページ: e53514
  • DOI: 10.7554/eLife.53514
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Structural insights into tetraspanin CD9 function (2020)
  • 著者名/発表者名: Umeda Rie、Satouh Yuhkoh、Takemoto Mizuki、Nakada-Nakura Yoshiko、Liu Kehong、Yokoyama Takeshi、Shirouzu Mikako、Iwata So、Nomura Norimichi、Sato Ken、Ikawa Masahito、Nishizawa Tomohiro、Nureki Osamu
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 11 ページ: 1606
  • DOI: 10.1038/s41467-020-15459-7
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The discovery of a new antibody for BRIL-fused GPCR structure determination (2020)
  • 著者名/発表者名: Miyagi Hikaru、Asada Hidetsugu、Suzuki Michihiko、Takahashi Yuichi、Yasunaga Mai、Suno Chiyo、Iwata So、Saito Jun-ichi
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 10 ページ: 11669
  • DOI: 10.1038/s41598-020-68355-x
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Structure of an antagonist-bound ghrelin receptor reveals possible ghrelin recognition mode (2020)
  • 著者名/発表者名: Shiimura Yuki、Horita Shoichiro、Hamamoto Akie、Asada Hidetsugu、Hirata Kunio、Tanaka Misuzu、Mori Kenji、Uemura Tomoko、Kobayashi Takuya、Iwata So、Kojima Masayasu
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 11 ページ: 4160
  • DOI: 10.1038/s41467-020-17554-1
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Atg9 is a lipid scramblase that mediates autophagosomal membrane expansion (2020)
  • 著者名/発表者名: Matoba Kazuaki、Kotani Tetsuya、Tsutsumi Akihisa、Tsuji Takuma、Mori Takaharu、Noshiro Daisuke、Sugita Yuji、Nomura Norimichi、Iwata So、Ohsumi Yoshinori、Fujimoto Toyoshi、Nakatogawa Hitoshi、Kikkawa Masahide、Noda Nobuo N.
  • 雑誌名: Nature Structural & Molecular Biology 巻: 27 ページ: 1185～1193
  • DOI: 10.1038/s41594-020-00518-w
  • 査読あり
• [雑誌論文] Isoprenoid-chained lipid EROCOC17+4: a new matrix for membrane protein crystallization and a crystal delivery medium in serial femtosecond crystallography (2020)
  • 著者名/発表者名: Ihara Kentaro、Hato Masakatsu、Nakane Takanori、Yamashita Keitaro、Kimura-Someya Tomomi、Hosaka Toshiaki、Ishizuka-Katsura Yoshiko、Tanaka Rie、Tanaka Tomoyuki、Sugahara Michihiro、Hirata Kunio、Yamamoto Masaki、Nureki Osamu、Tono Kensuke、Nango Eriko、Iwata So、Shirouzu Mikako
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 10 ページ: 19305
  • DOI: 10.1038/s41598-020-76277-x
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Isolation and thermal stabilization of mouse ferroportin (2020)
  • 著者名/発表者名: Deshpande Chandrika N.、Azucenas Corbin R.、Qiao Bo、Nomura Norimichi、Xin Vicky、Font Josep、Iwata So、Ganz Tomas、Nemeth Elizabeta、Mackenzie Bryan、Jormakka Mika
  • 雑誌名: FEBS Open Bio 巻: 11 ページ: 26～34
  • DOI: 10.1002/2211-5463.13039
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Structure of the dopamine D2 receptor in complex with the antipsychotic drug spiperone (2020)
  • 著者名/発表者名: Im Dohyun、Inoue Asuka、Fujiwara Takaaki、Nakane Takanori、Yamanaka Yasuaki、Uemura Tomoko、Mori Chihiro、Shiimura Yuki、Kimura Kanako Terakado、Asada Hidetsugu、Nomura Norimichi、Tanaka Tomoyuki、Yamashita Ayumi、Nango Eriko、Tono Kensuke、Kadji Francois Marie Ngako、Aoki Junken、Iwata So、Shimamura Tatsuro
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 11 ページ: 6442
  • DOI: 10.1038/s41467-020-20221-0
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Beyond the molecular movies (2021)
  • 著者名/発表者名: 岩田想
  • 学会等名: SACLA Users' Meeting
  • 招待講演
• [学会発表] 抗体フラグメントを用いたGPCRの構造解析と創薬への応用 (2020)
  • 著者名/発表者名: 岩田想
  • 学会等名: 第93回日本生化学会大会
  • 招待講演
• [図書] “The Intervening Removable Affinity Tag (iRAT) System for the Production of Recombinant Antibody Fragments” in Methods Mol Biol. (2021)
  • 著者名/発表者名: *Nomura N, Nomura Y, Sato Y and *Iwata S.
  • 総ページ数: 340ページ
  • 出版者: Humana Press
  • ISBN: 978-1-0716-1125-8