| 研究課題/領域番号 |
19H00924
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
中谷 和彦 大阪大学, 産業科学研究所, 教授 (70237303)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | リピート配列 / DNA / 低分子 / 化学修飾 / リピート短縮 / デアミナーゼ |
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| 研究実績の概要 |
本申請研究では、異常伸長リピートに特異的に結合し、リピート配列が形成するヘアピン内のシトシンをウラシルへ化学変換反応を加速する分子の創成を目指して、シトシンの３位窒素もしくは４位アミノ基を化学修飾できる化合物NCD-epoを合成し、その化学反応性とC→Uへの化学変換効率を調べてきた。NCDはCGG/CGG配列に結合する分子であり、結合によりフリップアウトするCのアルキル化を目指しNCDとエポキシ基をつなぐリンカー構造の誘導体を合成したが、反応性を上げるためにリンカー長を短くすると、NCD-epo自身の化学的反応性が極端に低下することが明らかとなった。リピート結合分子（NCD-epo）の化学的不安定性について考察した結果、ナフチリジン１位の窒素、もしくは、NCD-epoのリンカー中央にある三級窒素の求核攻撃により、エポキシ環が開環している可能性が挙げられた。エポキシ基自体が求核攻撃を受けやすい官能基であり、その反応性によりシトシンのアルキル化が狙えることを考え合わせると、NCD-epoの化学的安定性と標的に対する高い化学的反応性を同時に満足する分子の設計は極めて難しいと判断し、NCD-epoの開発を終了することとした。本研究の目的を達成するために、シトシンの脱アミノ化には、生体内に通常存在しているシトシンデアミナーゼを活用することとし、APOBECファミリーシトシンデアミナーゼを用いた検討を開始した。APOBECファミリーシトシンデアミナーゼは市販されていないため、国立感染症研究所の村松先生から発現用ベクターをご恵与いただき、デアミナーゼを調製した。CXGリピート配列に対して、結合分子のある無しによるデアミナーゼの効果を検討し、リピート配列依存的なデアミナーゼ活性を持つことを確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
まず、シトシンをアルキル化する分子の設計と合成に相当の研究時間を費やしたが、修飾分子自体の化学的安定性と標的に対する高い化学反応性を共に満足する分子の創製には至らなかった。より反応性の高い標的配列を用いることも可能であるが、疾患関連配列ではなくなることから、化合物の開発は断念した。シトシン脱アミノ化の代替法として、シトシンデアミナーゼを用いる手法に切り替えたが、シトシンデアミナーゼ自体の調製から始めなくてはならないことから、当初の計画に比べて遅れていることは否めない。
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| 今後の研究の推進方策 |
APOBECファミリーのシトシンデアミナーゼの調製は完了しており、シトシンの脱アミノ化によるウラシルの生成と、ウラシルDNAグリコシダーゼによる基質DNAの切断バンド確認での反応検出系を確立しており、今後の研究加速が期待される状況である。尚、基質DNAの配列とAPOBECシトシンデアミナーゼサブタイプの組み合わせが反応効率を決定することから、組み合わせの決定には多少時間を要することが予想される。
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