| 研究課題/領域番号 |
19H00926
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| 研究機関 | 兵庫県立大学 |
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研究代表者 |
城 宜嗣 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 教授 (70183051)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 一酸化窒素還元酵素 / 脱窒 / 嫌気呼吸 / 髄膜炎菌 / 緑膿菌 / クライオ電子顕微鏡 / 時間分解解析 |
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| 研究実績の概要 |
緑膿菌の一酸化窒素還元酵素（cNOR）と髄膜炎菌の一酸化窒素還元酵素（qNOR）を研究対象とした。cNORに関しては、caged NO（紫外光照射によりNOを放出）と 時間分解分光解析を組み合わせた測定により、三段階のステップで反応が進行する独自の反応機構を論文として報告した。この反応機構では、２つの短寿命反応中間体が生成するが、第一の反応中間体（数マイクロ秒の寿命）の電子状態・配位構造に関しては、 時分割赤外分光とESR測定に成功し、非ヘム鉄にNOが一分子配位した構造を提案できた。第二の反応中間体（数百マイクロ秒の寿命）に関しては確定していなかった。そこで、プロトンの供給を遮断して第二反応中間体の寿命を長くした変異体（E57A）のESR測定を試みた。以上に加えて、この２つの短寿命反応中間体の結晶構造解析を目指して、嫌気条件下、caged NO存在下でのcNORの結晶作成の条件を検討した。
cNORとの反応機構に相違があるのかを確認する目的で、髄膜炎菌qNORとcagedNOを用いた時間分解仏光測定を行った。反応速度はqNORの方が速いが、cNOR同様に三段階の反応ステップで反応が進行することを確認した。
髄膜炎菌qNORの低温電子顕微鏡（クライオEM）を用いた溶液構造の分解能をより高くする目的で、二量体と単量体のqNORとナノディスク複合体の調製条件の詳細に検討した。電子供与体の結合部位周辺のアミノ酸残基に変異を導入し、それら変異体の活性を測定し、大きく低下していることを確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
一酸化窒素還元酵素cNORの酵素反応中に現れる短寿命反応中間体のうち、第一の反応中間体（寿命;数マイクロ秒）の解析は順調に進んだが、第二反応中間体 （寿命が数百マイクロ秒）の電子状態と配位構造は確定できていない。 これらの反応中間体の安定化に、77Kでのcaged NOの紫外光照射（クライオフォトリシス法）と185Kへのアニーリングの手法が使える事が分かったので、E57A変異体を用いてESR測定を行う。なた、この手法をcNOR結晶に適用してcNOR第一反応中間体の構造解析の可能性が高くなった。
髄膜炎菌qNORがクライオ電子顕微鏡解析が進み、さまざまな状態で高い分解能の構造を得る事ができる膜タンパク質である事がわかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続き、変異体（E57A）を用いてcNORの第二反応中間体の捕捉をESR測定で行う予定である。
さらに、クライオフォトリスとアニーリング法を適用し、cNORの第一反応中間体のX線結晶構造解析を行う。
髄膜炎菌qNORの単量体、二量体の阻害剤・電子供与体結合型とナノディスク複合体のクライオ電子顕微鏡構造解析を行う。
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