時間分解構造解析を活用した一酸化窒素還元酵素の構造ダイナミクス研究

2021 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 19H00926
• 研究機関: 兵庫県立大学
• 研究代表者: 城 宜嗣 兵庫県立大学, 理学研究科, 教授 (70183051)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2023-03-31
• キーワード: 一酸化窒素還元酵素 / 脱窒 / 嫌気呼吸 / 髄膜炎菌 / クライオ電子顕微鏡 / 時間分解構造解析

研究実績の概要

バクテリアの一酸化窒素還元酵素はヘム鉄と非ヘム鉄よりなる複核錯体を反応中心として、以下の酵素班のを触媒する：2NO + 2H+ + 2e- --> N2O + H2O。緑膿菌の一酸化窒素還元酵素（cNOR）と髄膜炎菌の一酸化窒素還元酵素（qNOR）を研究対象とした。一昨年度には、cNORの酵素反応は２つの短寿命反応中間体を生成をふくむ三段階の素反応で進む事を明らかにした。時間分解赤外分光法とクライオアニーリングESR法によって、第一反応中間体（マイクロ秒の寿命）は、一分子のNOが非ヘム鉄に配位した状態であると提案した。その配位構造をさらに詳細に決定するために、時間分解X線結晶構造解析を試みることとし、その準備実験を行った。酸素バリアフィルムを用いた酸素非存在下での、反応中心の鉄が還元された状態での結晶化と結晶状態での酵素反応の観測に成功した。第二反応中間体（数ミリ秒の寿命）を電子状態と配位構造を詳細に検討するために、プロトン供給経路を遮断した変異体を調製した。この変異体は第二反応中間体の反応性の低下によって酵素活性が大きく減少した。現在、クライオアニーリング法を用いた解析を行っている。
qNORは、結晶構造解析よりも低温電子顕微鏡に適した酵素である事を昨年度までに明らかにした。そこで、この方法を用いてqNORの二量体と単量体の構造解析に成功した。両者の構造比較から、二量体が単量体よりも活性が高い原因が、プロトン供給経路の安定化によるものと結論できた。阻害剤による酵素反応阻害の機構を明らかにする目的で、阻害剤結合型のqNORの構造を解析中である。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

cNORの第一反応中間体の解析は、ほぼ終了した。その時間分解構造解析は挑戦的要素が強く、手法の開発を模索しながらの進展となる。第二反応中間体はその構造・電子状態は、時間分解可視吸収スペクトルの測定から予測はできているが、未だに決定的な実験的証拠は得られていない。プロトン輸送遮断の変異体を用いた実験に期待している。
qNORは、低温電子顕微鏡による構造解析に適した試料であることから、非常に順調に進展している。

今後の研究の推進方策

cNORの第一および第二反応中間体の詳細な解析は続ける。また、亜硝酸還元酵素NiRの存在した状態での反応解析もおこなう。
qNORは病原菌がマクロファージの放出する抗菌ガスNOの無毒化に機能していることから、その阻害剤は抗菌薬のターゲットとなる。化合部バンクを用いたスクリーニングにより、抗菌薬候補となる化合物を選択する。その化合部とqNORとの複合体の構造解析により、阻害メカニズムの詳細を議論する。

研究成果

• [国際共同研究] University of Liverpool/University of Bristol/University of Leicester(英国)
  • 国名: 英国
  • 外国機関名: University of Liverpool/University of Bristol/University of Leicester
• [雑誌論文] Coordination and Electronic Structures of Short-Lived Intermediate in NO Reduction by Cytochrome P450 NO Reductase as Characterized by Time-Resolved IR Spectroscopy and XFEL Crystallography (2021)
  • 著者名/発表者名: T. Nomura, T. Kimura, Y. Kanematsu, K. Yamashita, K. Hirata, G. Ueno, H. Murakami, T. Hisano, R. Yamagiwa, H. Takeda, C. Gopalasingam, Y. Kino, R. Kousaka, S. Yanagisawa, O. Shoji, T. Kumasaka, Y. Takano, H. Ago, M. Yamamoto, H. Sugimoto, T. Tosha, M. Kubo, Y. Shiro
  • 雑誌名: Proc. Natl. Acd. Sci. USA 巻: 118 ページ: e2101481118
  • DOI: 10.1073/pnas.2101481118
  • 査読あり
• [雑誌論文] XFEL Crystal Structures of Peroxidase Compound II (2021)
  • 著者名/発表者名: H. Kwon, J. Basran, C. Pathak, M. Hussain, S. Freeman, A. Fielding, A. Bailey, N. Stefanou, H. Sparkes, T. Tosha, K. Yamashita, K. Hirata, H. Murakami, G. Ueno, H. Ago, K. Tono, M. Yamamoto, H. Sawai, Y. Shiro, H. Sugimoto, E. Raven, P. Moody
  • 雑誌名: Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 巻: 60 ページ: 14578-14585
  • DOI: 10.1002/anie.202103010
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Regulatory Switching by Concerted Motions in the Microsecond Time Range of the Oxygen Sensor Protein FixL (2021)
  • 著者名/発表者名: T. Yamawaki, M. Mizuno, H. Ishikawa, K. Takemura, A. Kitao, H. Nakamura, Y. Shiro, Y. Mizutani
  • 雑誌名: J. Phys. Chem. 巻: 125 ページ: 6847-6856
  • DOI: 10.1021/acs.jpcb.1c01885
  • 査読あり
• [雑誌論文] Spatially Restricted Active Site of Cortisol-Synthesizing Enzyme Executes α-Hydroxylation and Hinders Aldosterone Synthesis (2021)
  • 著者名/発表者名: K. Mukai, H. Sugimoto, K. Kamiya, R. Suzuki, T. Matsuura, T. Hishiki, Y. Shiro, H. Shimada, N. Kagawa
  • 雑誌名: Curr. Res. Struct. Biol. 巻: 3 ページ: 192-205
  • DOI: 10.1016/j.crstbi.2021.08.001
  • 査読あり
• [学会発表] 鉄の生体内動態の分子科学 (2022)
  • 著者名/発表者名: 城 宜嗣
  • 学会等名: 第２回レドックスR&D戦略委員会 春のシンポジウム 最先端技術が切り拓くレドックスバイオロジー
  • 招待講演
• [学会発表] Time-resolved Techniques Provide Mechanism for Nitric Oxide Reduction by Nitric Oxide Reductase (2021)
  • 著者名/発表者名: T. Tosha, H. Takeda, Y. Shiro and M. Kubo
  • 学会等名: The International Chemical Congress of Pacific Basin Societies 2021 (Pacifichem 2021)
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 分子構造を基盤にした鉄結合タンパク質の機能解明 生命金属科学への展開をめざして (2021)
  • 著者名/発表者名: 城 宜嗣
  • 学会等名: 第15回バイオ関連化学シンポジウム
  • 招待講演
• [学会発表] 光解離性ケージド基質を利用した一酸化窒素還元酵素の反応機構の解明 (2021)
  • 著者名/発表者名: 當舎武彦
  • 学会等名: 第94回日本生化学大会
  • 招待講演
• [学会発表] Probing Functional and Structural Differences of Quinol-dependent Nitric Oxide Reductases’ (qNOR) within a Lipidic Nanodisc Environment (2021)
  • 著者名/発表者名: C. Gopalasingam
  • 学会等名: Protein Science Society of Japan Annual Meeting
  • 招待講演
• [備考] 兵庫県立大学大学院理学研究科細胞制御学Ⅱ講座
  • URL: https://www.sci.u-hyogo.ac.jp/life/regulation/index-j.html
• [備考] 兵庫県立大学大学院理学研究科細胞膜超分子複合体機能解析学講座
  • URL: http://www2.riken.jp/biometal/index.htm