| 研究課題/領域番号 |
19H00936
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| 研究機関 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 |
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研究代表者 |
宮崎 健太郎 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 研究グループ長 (60344123)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | ホーミングエンドヌクレアーゼ / 機能改変 / 低温適応 |
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| 研究実績の概要 |
令和3年度は、 昨年度までに環境メタゲノムより得られた機能性23S rRNA遺伝子を保持する大腸菌変異株の詳細な解析を行った。特に、増殖速度の低下した変異株（Mmeと命名、ガンマプロテオバクテリに属するMarinomonas mediterranea由来23S rRNAを保持)変異株に着目した。なお、23S rRNAと16S rRNAの置換の影響を比較するため、M. mediterranea由来の16S rRNA置換変異株も作成したが、こちらは23S rRNAの時とは違い宿主の生育に大きな影響を与えなかった。また、大腸菌16S rRNAとMme 23S rRNA（Eco-Mme）、Mme 16S rRNAとMme 23S rRNA（Mme-Mme）の両方が置き換わった株との間でも大きな差は見られず（ややEco-Mmeの生育が良好）、置換の影響は23S rRNAの方が大きいと結論された。
Mme23S rRNA変異株の継代培養の過程で増殖復帰株が得られたため、進化前後での比較ゲノム解析を行ったところ、リボソーム関連因子としては、リボソームタンパク質L13遺伝子上流のプロモーター領域に点変異が確認された。この変異は、Eco-Mmeだけでなく、Mme-Mmeにおいても効果的であった。
一方、増殖の低下を招かない機能性23S rRNA遺伝子については、タンパク質発現の宿主として候補としてストックし、今後の異種発現用の候補とすることとした。
Rhodothermus marinus由来のホーミングエンドヌクレアーゼ については、以前構築した発現系を使用し、site-scanning saturation mutagenesisライブラリーの構築を進めた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
高機能23S rRNA遺伝子の取得 については、生育の良好な大腸菌変異株も得られており、異種遺伝子発現効率の向上も期待できる段階にきている。
一方、Rhodothermus marinus由来ホーミングエンドヌクレアーゼI-RmaIの酵素学的解析については、発現系の構築を完了しているが、低温適応のための変異ライブラリーの構築を進めている段階である。ハイスループット系の構築が停滞しており、実際の活性スクリーニングには至っていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
高活性型の23S rRNAに野生型のI-RmaI遺伝子を組み込み、さらにゲノム内への組み込みを進めたい。大腸菌のゲノム編集技術については、研究開始当初よりも大きな進展があることから、ゲノムへの組み込みについてはcrispr-cas等の使用も視野に入れる。
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