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昨年度までに獲得した異種23S rRNA遺伝子にRhodothermus marinus由来のホーミングエンドヌクレアーゼを含むイントロンを挿入した際、期待したプロセッシングを受けなかったため、改めて新規な異種23S rRNA遺伝子のスクリーニングを行った。高温環境などを含めた多様な環境より23S rRNA遺伝子をPCR増幅し、生育相補スクリーニングを行い、集積培養を行い、変異株ライブラリーを構築した。
当該23S rRNAに対し、ホーミングエンドヌクレアーゼを含むイントロンを23S rRNA遺伝子配列中に組み込んだ。ホーミングエンドヌクレアーゼの挿入部位は配列保存性が高く、ライブラリー全体としても正しくプロセッシングを受ければ機能を損なうことがないと考えられる。しかし結果としては、ライブラリーに含まれる23S rRNAの融合遺伝子でリボソームオペロン完全欠失株を機能相補することはできなかった。
以前の結果同様、好熱菌由来のホーミングエンドヌクレアーゼが宿主内で十分な活性を示さないためであると推測された。ホーミングエンドヌクレアーゼや23S rRNAのランダム変異導入なども試みたが、生育相補可能な変異体は得られなかった。
大腸菌23S rRNA遺伝子に組み込んだ場合については、些細な実験条件の違いで相補が見られる場合とそうでない場合があり、安定した機能を再現させることが困難であった。
一方、大腸菌内で発現したホーミングエンドヌクレアーゼについては性状解析を行い、論文化を進めた。
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