ヒドロゲナーゼの触媒反応機構と高効率プロトン伝達機構の構造基盤解明

2022 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 19H00984
• 研究機関: 兵庫県立大学
• 研究代表者: 樋口 芳樹 兵庫県立大学, 理学研究科, 特任教授 (90183574)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2024-03-31
• キーワード: ヒドロゲナーゼ / 中性子結晶解析 / X線結晶解析 / プロトン経路 / ラマン分光法 / 酵素活性定量法 / 酸素耐性酵素

研究実績の概要

（1）ヒドロゲナーゼの中性子結晶構造解析：日本原子力開発研究機構・大強度陽子加速器施設（J-PARC）において測定した酸化型標準的酵素の中性子結晶回折データを解析した．その結果，「結晶中およそ30%の分子のNi-Fe活性部位に見られる歪んだ構造」について高分解能X線結晶解析による精密化をさらに進展させることができた．この特異な構造は，赤外線吸収スペクトルに未同定として記録されていたバンドに帰属できると考えられる．水素や重水素によって還元させた酵素の巨大結晶の調製では，結晶内部が完全に還元されていないことがわかり，還元時間を延ばす，あるいは，水素の圧力を上げる等の還元方法の改善が必要であることが判明した．
（2）ヒドロゲナーゼの酸素耐性機構・一般則の確立（分子内の水分子の役割解明）：NAD+還元ヒドロゲナーゼは，Ni-Fe活性部位自体が酸素による修飾を防御する分子機構を備えている．このNAD+還元ヒドロゲナーゼの酸化型の「結晶」についてFT-IRによる構造解析を進展させた結果，酸化型構造においては，活性部位近傍のグルタミン酸側鎖がNi原子に配位してNi(Ⅳ)を安定化して酸素耐性を維持していることを見出した．この時，X線結晶構造においては，グルタミン酸近傍の水分子が移動していることを再確認した．本結果を米国化学雑誌・J.Am.Chem.Soc.誌に発表した．
（3）ラマン分光法による触媒活性定量法の開発：　昨年度に引き続き，酵素と基質（気体水素）の反応が主に酵素溶液相と気相との界面で起こっていることを確認するため，酵素溶液をエアロゾルにして気相中に浮遊させて酵素触媒反応の定量する方法の開発を進めた．

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

水素還元型[NiFe]ヒドロゲナーゼの中性子結晶構造解析は大型結晶の水素還元方法の確立に至っていないが，酸化型酵素の結晶中に見出した「Ni-Fe活性部位の歪んだ構造」の構造解析結果については，論文にまとめて投稿するところまで進展させた．
また，Citrobacter由来[NiFe]ヒドロゲナーゼについて，水素の競争阻害剤である一酸化炭素との結合についての詳細を発表した．また，NAD+還元ヒドロゲナーゼの酸化型について結晶FT-IR法による構造解析を進展させた結果，活性部位近傍のグルタミン酸側鎖が配位しているNi原子の価数が，Ni(Ⅳ)であることを見出した．この構造が本酵素の酸素耐性維持に重要であるという結果と考察を米国化学雑誌・J.Am.Chem.Soc.誌に発表した．ラマン分光法による触媒活性定量法の開発では，酵素反応の気-液界面反応性を証明するために，酵素溶液をエアロゾルにして測定する方法の開発を進めた．

今後の研究の推進方策

（1）[NiFe]ヒドロゲナーゼの高分解能中性子結晶構造化学
酵素分子をH+（またはD+）でラベルした結晶について，高分解能の中性子回折全データの取得を試みる．中性子回折データの取得に成功した場合，同じ結晶からSPring-8にて超高分解能のX線回折データを収集し，中性子およびX線回折データの両方を用いて構造精密化を行い，最終的にプロトン経路を同定する．また，酸化型酵素に見出した活性部位の構造変化の理由を理論化学計算に基づいて考察する．
（2）ヒドロゲナーゼの酸素耐性機構・一般則の確立（分子内の水分子の役割解明）
NAD+還元ヒドロゲナーゼの酸素からの防御機構について，活性部位の特徴的な反応中間体構造に着目して，引き続き結晶FT-IRおよび結晶EPR等の分光学的な測定を続ける．また，当該酵素と進化的に関係づけられている酸素耐性酵素（ギ酸脱水素酵素：FODH）のX線結晶解析を進め，酸素耐性についての共通の分子機構を考察する．
（3）ラマン分光法による触媒活性定量法の開発
再現性の高いラマン散乱データを得るために改良した酵素反応セルを用いて本測定方法を確立するとともに，酵素溶液をエアロゾルにした試料を用いて酵素活性を高精度に定量できるか調査を続ける．

研究成果

• [国際共同研究] Technical University Berlin/Free University Berlin(ドイツ)
  • 国名: ドイツ
  • 外国機関名: Technical University Berlin/Free University Berlin
• [国際共同研究] University of Innsbruck(オーストリア)
  • 国名: オーストリア
  • 外国機関名: University of Innsbruck
• [雑誌論文] Structural and Spectroscopic Characterization of CO Inhibition of [NiFe]-hydrogenase from Citrobacter sp. S-77 (2022)
  • 著者名/発表者名: T. Imanishi, K. Nishikawa, M. Taketa, K. Higuchi, H. Tai, S. Hirota, H. Hojo, T. Kawakami, K. Hataguchi, K. Matsumoto, H. Ogata and Y. Higuchi
  • 雑誌名: Acta Crystallogr. 巻: F78 ページ: 66-74
  • DOI: 10.1107/S2053230X22000188
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structural Insights into the Very Low Activity of the Homocoenzyme B12 Adenosylmethylcobalamin in Coenzyme B12-dependent Diol Dehydratase and Ethanolamine Ammonia-lyase (2022)
  • 著者名/発表者名: N. Shibata, Y. Higuchi, B. Krautler and T. Toraya
  • 雑誌名: Chemistry-A Europ. J. 巻: 28 ページ: e202202196
  • DOI: 10.1002/chem.202202196
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Reversible Glutamate Coordination to High-valent Nickel Protects the Active Site of a [NiFe] hydrogenase from Oxygen (2022)
  • 著者名/発表者名: C. J. Kulka-Peschke, A-C. Schulz, C. Lorent, Y. Rippers, S. Wahlefeld, J. Preissler, C. Schulz, C. Wiemann, C. C. M. Bernitzky, C. Karafoulidi-Retsou, S. L. D. Wrathall, B. Procacci, H. Matsuura, G. M. Greetham, C. Teutloff, L. Lauterbach, Y. Higuchi, M. Ishii, N.T. Hunt, O. Lenz, I. Zebger, M. Horch
  • 雑誌名: J. Am. Chem. Soc. 巻: 144 ページ: 17022-17032
  • DOI: 10.1021/jacs.2c06400
  • 査読あり / 国際共著
• [学会発表] Conversion of a Monomeric Protein into a Domain-swapped Dimer by Utilizing a Tight Hydrogen Bond Network at the Hinge Region for Myoglobin (2022)
  • 著者名/発表者名: Cheng Xie, Hiromitsu Shimoyama, Masaru Yamanaka, Satoshi Nagao, Hirofumi Komori, Naoki Shibata, Yoshiki Higuchi, Yasuteru Shigeta and Shun Hirota
  • 学会等名: 10th Asian Biological Inorganic Chemistry (AsBIC10)
  • 国際学会
• [学会発表] NEUTRON AND X-RAY DIFFRACTION STUDIES ON THE OXIDIZED STATE OF [NIFE]-HYDROGENASE FROM D. VULGARIS MIYAZAKI F (2022)
  • 著者名/発表者名: Takeshi Hiromoto, Koji Nishikawa, Taro Tamada, Yoshiki Higuchi
  • 学会等名: 2nd International Symposium "Hydrogenomics"
  • 国際学会
• [学会発表] Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F株由来[NiFe]-ヒドロゲナーゼ酸化型の中性子／X線結晶構造解析 (2022)
  • 著者名/発表者名: 玉田 太郎、廣本 武史、西川 幸志、樋口 芳樹
  • 学会等名: 第22回日本蛋白質科学会年会
• [学会発表] Axinオリゴマーの構造変化を介したWntシグナル伝達制御の構造基盤 (2022)
  • 著者名/発表者名: 寺脇慎一、藤田祥平、中込蒼一朗、石渡拓也、清水結加、笠野一郎、井上裕介、塩見健輔、桝正幸、柴田直樹、樋口芳樹、若松馨
  • 学会等名: 第95回日本生化学会
• [学会発表] X線回折データを相補的に用いたヒドロゲナーゼ酸化型の中性子結晶構造解析 (2022)
  • 著者名/発表者名: 廣本 武史、西川 幸志、樋口 芳樹、玉田 太郎
  • 学会等名: 日本結晶学会2022年度年会