| 研究課題/領域番号 |
19H00994
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
近藤 滋 大阪大学, 生命機能研究科, 教授 (10252503)
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| 研究分担者 |
船山 典子 京都大学, 理学研究科, 准教授 (30276175)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 棒状構造 / アクチノトリキア / 針状骨片 / カイメン / セブらフィッシュ / 鰭 |
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| 研究実績の概要 |
近藤チーム
前年度に、ＭＣがＡＣを整列させることをインビトロで観察することができたが、今年度はそれをインビボで確認することができた。具体的には、ＭＣで、膜状突起形成を阻害するドミナント遺伝子変異を導入することで、その遺伝子が導入された部位でＡＣの配向が乱れ、バラバラの並びになることが確認されたのである。これにより、ＡＣをヒレの先端部において整列させるのがＭＣであるということが、インビボ、インビトロの両方で証明された。また、予想外の発見もあった。ＡＣをパルス染色し、個々のＡＣの動態を観察したところ、ＡＣが先端部に向かって常に移動していることを見出した。これにより、ACを産生する細胞が存在しない鰭最先端部ＡＣが存在する理由が推測できる。また、損傷したＡＣが基部に向かって移動し、分化されることも解った。このＡＣの輸送は今後の研究の中心となる。
船山チーム
カワカイメン骨片骨格形成過程で働くTransport cellsなど特定の細胞種の詳細な細胞挙動ライブイメージングと解析のために、２０１９年度に得られた知見を元に、１）カワカイメンゲノムへの遺伝子導入法の確立、２）Transport cellsで特異的に発現するEflSoxB遺伝子の上流配列（プロモーター領域）の取得と、３）遺伝子機能解析を行う基礎として、蛍光タンパク質との誘導タンパク質の一過的な発現と解析を目的とした。コロナ感染拡大防止のため、２０２０年度は思うように研究を進められず、１）についてはまだ成功に至らず、プロモーターの検討を行っている。しかし、２）のEflSoxB遺伝子上流配列を得ることが出来、３）に関しては、複数分子に関し蛍光タンパク質との融合分子発現プラスミドの作成、プレリミナリーながら一過的な発現を確認できた分子もある。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
近藤チームの成果として、インビボ、インビトロにおいてACとMCの関係を完全に証明できたことは非常に重要である。これにより、当初期待していた成果がほぼ出たと言っても良いくらいの十分な成果であると考えている。また、アクチノトリキアの輸送という極めて予想外の、しかも重要な現象を発見したことは、今後の研究に大きな影響を与える。これまで、ゼブラフィッシュのACとカイメンの骨片には、「移動」の有無という明らかな違いがあると認識していたため、その違いをどのように理解するかが問題であったが、今回、ACも細胞により運ばれて移動することが解ったことで、カイメンとゼブラフィッシュの間で、極めて同じロジックによる形態形成原理が働いていることが解ったからである。
船山チームの主な進展は、技術面でのブレイクスルーである。カワカイメンは系統化されていず、ゲノム編集法を用いることが困難であることから、最終的にはトランスポゾン由来の組み換え酵素を用いたゲノムへの遺伝子挿入法を試みたが成功に至っていない。脊椎動物に最適化されているプロモーターを、カワカイメンで働くことを確認しているプロモーターに変更したプラスミドを作成したところである。２）インバースＰCR法でEflSoxB遺伝子上流約600ｂｐのゲノムＤNAを取得、さらにドラフトゲノムデータから検索したところ、得たゲノムDNA配列を含む約1.2kbの配列データを得た。現在この配列がプロモーターとして働くことを期待した蛍光タンパク質発現ベクターを作成中である。これまでにプレリミナリーながら融合タンパク質の一過的な発現を確認出来た。今後、この手法をより改善して、3年目における研究の完成につなげる。
以上より全体としては期待以上の成果が上がっていると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
近藤チーム
実験においては、当初の予定にはなかったが、ACの先端部への移動を中心に進めたい。まず、ACの移動に貢献する細胞を特定する。具体的には、ACの周囲にあるBK細胞、MC細胞、OB細胞をそれぞれ別の蛍光色で可視化し、どの細胞が、先端部に移動するACと同じ方向に動くかを観察する。次に移動中のACと運搬細胞を特定したらその状態で固定しFIB-SEMにより、その３D形態を取得する。これはかなり難しいが何とか成功させたい。上記の実験で移動の様子が解れば、それをMCによる整列作用と合わせて、数理モデル化を行い、ヒレ形成の全体象を明らかにしたい。既に、MCによるACの整列に関しては、京都大学立川正志先生との協力により、２Dのシミュレーションによる再現に成功しており、それを今後３Dに拡張する予定である。可能であればその系にACの先端部への移動も含めた統合モデルの作成を目指したい。
船山氏チーム
引き続きゲノムへの遺伝子挿入法の確立に取り組む。一方、骨格骨片とは別タイプの骨片を用い「産生」、「運搬・配置」・「繋げる（コラーゲンで周囲を埋め、芽球骨片がコラーゲンコートに埋め込まれた形状になる）」形作りである、芽球コート形成過程に着目した新たな切り口の解析を開始する。具体的には、芽球骨片配置に関わると考えられる「コラーゲン発現芽球上皮細胞」に着目、芽球上皮細胞層の形成と、分泌されたコラーゲン層の形成による、芽球の形作りのライブイメージングと画像解析を行い、芽球コートの形作り機構を物理力の関与の観点から解析する。
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