| 研究課題/領域番号 |
19H01022
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| 研究機関 | 国立研究開発法人国立循環器病研究センター |
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研究代表者 |
望月 直樹 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 研究所長 (30311426)
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| 研究分担者 |
中嶋 洋行 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 室長 (10467657)
迫 圭輔 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 上級研究員 (50786291)
福井 一 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 室長 (80551506)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 左右非対称性 / ゼブラフィッシュ / 情報伝達系 / 中胚葉 / クッパ―胞 / 繊毛 |
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| 研究実績の概要 |
生体の軸形成（前後、背腹、左右）の中で臓器配置の左右非対称性を生じるメカニズムの解明を目的にして研究を実施している。左右差は、哺乳類では、ノードの繊毛回転によるノード内の左右差により、ノード左方と右方の情報伝達の相違による左右差が体節両側の相違、つまり左右差を形成されると考えられている。
本研究では、哺乳類のノードに相当するゼブラフィッシュのKupffer’s vesicle (KV)の繊毛の回転（流れ）と引き続くNodal シグナルの重要性に着目して繊毛依存性のCa2+ の左右差や繊毛自体のCa2+ の左右差、Southpaw がどの細胞から始まるかなどを詳細に調べてきた。昨年度までにBMP シグナルのレポータートランスジェニック個体を作製してSmad1, 5, 8依存性の転写活性を可視化し、Smad4によるレポーターも作製したが、本年度は、さらにNotchレポーター観察を行った。
KV が形成される前のdorsal forrnner cellが集団を形成して前方から尾側に向けて移動する際のCa2? シグナルの左右差とともにNotchレポーターの左右差も調べたが、Notch日刊しては、左右差を認めなかった。Spawは明らかに左右差が出現するが、これまでに報告されているように、KVの周囲からSpawが発現して、前方にSpaw陽性細胞が広まるという現象は観察されなかったことから、ＫＶが起点となって、Spaw陽性細胞が出現するのではなく、KV形成が完成する前から左右差を決定する機構が存在することがわかった。draculin (中胚葉由来）陽性細胞とspawとの共発現細胞が中胚葉の左右差を認める臓器の元となる細胞と考えて、double Tgで同定を試みた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
Wnt, TGFβ/BMP, Notch, Hippo (Yap/Wwtr1 依存性転写）シグナルの可視化と左右差調節系の因果関係を調べるためのレポータートランスジェニックフィッシュの作製を進めてきている。またdorsal forrunner cell(DFC)集団がＫＶ形成にいたり、左右差を決定するまでにDFC 集団内あるいはＫＶ内に左右差が生じるのかも調べてきた。この過程では、Ca2+に関しては左右差がないことから、DFCの移動時に別のシグナル系による左右差形成過程がそんざいすることが示唆された。
ＫＶからのNodal sigunal の左右差については、Dand5の左右差があると報告されており、われわれもこのレポーターフィッシュを独自に作製して検討している。ただ、明確な左右差を示しておらず、Nodal シグナルによる左右差形成機構の関与はあるが、Spawのあきらかな左右発現の差を説明できる結果とはなっていない。Spawの発現が前方でも後方でもほぼ同時に見られることから、spaw発現すなわち、左右差を誘導するシグナルが早期から決定している可能性を強く示唆しており、ＫＶの形成以前にSpawの左右差決定機構の存在が考えられる結果となっている。
これまでに明確に左右差を検出できているのは Spaw や一部のNodalシグナルだけであり、これが中胚葉臓器・内胚葉臓器の左右差を持った配置にどのように関わるかは不明である。したがって、spawを含めて左右差発現が顕著な分子の発現制御過程を解明することによりさうくなくとも臓器の左右不均等の配置に至る情報伝達系機構が解明できると考えており、実際にこれまでの研究では進捗させていると判断する。
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| 今後の研究の推進方策 |
Tg(spaw:EGFP) の樹立と、Tg(draculin:mcherry) （中胚葉由来細胞の可視化）により、Spaw発現細胞と中胚葉由来細胞の相違と重なりを明らかにしつつある。Spaw発現が、KVの形成に依存することは、既報でも、我々の研究成果でも未達である。然るに、発生早期に左右差を示しているspawの上流因子、下流のシグナルを同定することが、不可欠と考える。
Spawの発現前に左右差を呈するシグナルを想定して、Notch, BMP, Wnt などを調べたが、明らかに左右差を検出することができなかったので、今後はSpaw陽性細胞で発現する受容体分子の同定により、Spawが陽性となるような情報伝達機構を明らかにすることが可能と考える。このために今後は、Spaw陽性細胞をソートして、そのRNA seqをすること、さらに scRNA-seqを実施して、spaw陽性細胞がいかなる情報伝達系を担う細胞であるかを突き止める。
これはこれまでの仮説であるKVからのシグナルが左側でspawを発現させるという前提とは異なり、我々独自の捉え方であり、また、spawの発現がKVが形成される尾側から徐々に見られるわけではないという事実からも妥当な考え方である。特にDFCs が吻側から尾側に移動するという現象と左右差が生じる関係を明らかにする上でもspawの上流シグナルを明らかにすることは、重要である。
さらに中胚葉だけではなく、内胚葉由来臓器も左右の不均等配置をすることからも内胚葉由来細胞の左右差を可視化できる個体の作成も考慮する。これまでに使用しているsox32, sox1７のレポーターでは、顕著な左右差を認めず、内胚葉由来細胞で左右差を検出できる個体の作成にも挑戦する。
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