| 研究課題/領域番号 |
19H01153
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| 研究機関 | 関西学院大学 |
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研究代表者 |
松田 祐介 関西学院大学, 理工学部, 教授 (30291975)
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| 研究分担者 |
米田 広平 関西学院大学, 理工学部, 助教 (10829104)
田中 厚子 琉球大学, 理学部, 助教 (40509999)
辻 敬典 京都大学, 生命科学研究科, 助教 (40728268)
原田 尚志 鳥取大学, 工学研究科, 准教授 (50640900)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 海洋性珪藻 / 二次葉緑体 / ピレノイド / 一次生産 / 光合成 |
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| 研究実績の概要 |
地球一次生産の約20%を担う海洋性珪藻類の生産機能の中心的役割を果たす葉緑体ピレノイドの構造、機能、およびその地球生態系への影響を見積もることを主眼とし、ゲノム情報および遺伝子改変ツールが整っている海洋性珪藻二種、Phaeodactylum tricornutumおよびThalassiosira pseudonanaを用いて研究をすすめた。
2019年度は、①光アミノ酸（PAA）という感光架橋性のジアジリン環を側鎖に持つ人工アミノ酸を珪藻のタンパク質合成系に取り込ませ、非破壊的にピレノイドを光固定した。これによって、新奇ピレノイド構成成分Pyshell、Best、ACCase、およびθ型炭酸脱水酵素を見出した。これら因子を②GFPタギングによって蛍光標識し、珪藻細胞に発現させた。蛍光の追跡および透過型電子顕微鏡観察によって細胞内局在を精査し、約半数の因子について局在を決定した。さらに ③構成成分の発現をRNA干渉、ゲノム編集、および過剰発現技術を用いてかく乱した変異体を取得した。一部、クロロフィル蛍光や酸素発生速度解析による機能解析に進んでいる。また、ゲノム編集技術として、CRISPR/Cas9ニッカーゼ法を珪藻で初めて確立し、査読付きジャーナルに発表した。
プロジェクト全体としては、④珪藻葉緑体構造・機能・動態の分子モデル化、および⑤海洋遺伝子動態ビッグデータの解析が含まれるが、本年度は上記①～③を主にすすめ、その成果は国内および国際会議でも報告した。国際学会ではベストポスター賞を受賞している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
① 二つの珪藻でピレノイド因子をPAAを用いて検索した結果、Pyshellと名付けた全く新規のピレノイド構成因子を各珪藻で2つずつ発見した。また、チラコイド膜に存在すると考えられる新奇陰イオン輸送体候補タンパクBestをやはり2つずつ発見した。脂質合成系初発酵素ACCaseをP.tricornutumで発見した。θ炭酸脱水酵素はT.pseudonanaにおいても発見され不等毛植物やハプト藻で普遍的因子であることが分かった。Pyshellとの相互作用因子と考えられるタンパク質を近位依存性ビオチン標識で選抜した。一方新奇葉緑体分裂因子DYN1遺伝子をクローニングした。
② Pyshellはピレノイド周辺に存在することが強く示唆される結果を得た。Bestはチラコイド膜に存在するが、P. tricornutumおよびT.pseudonanaでその位置は異なっており、それぞれ葉緑体全体のチラコイド膜およびピレノイド近傍のチラコイド膜であることが強く示唆された。ACCaseはピレノイド因子である可能性が強く示唆された。またT. pseudonanaのθ型炭酸脱水酵素は少なくとも3つあり、いずれもピレノイド近傍に局在、一つはピレノイド貫通チラコイドに局在することが強く示唆された。
③ Pyshellを過剰発現するといずれの珪藻でも光合成無機炭素親和性が低下した。Bestを過剰発現するとそれぞれの珪藻で2つのBestが正反対の影響を光エネルギーの散逸機構に与えることが示唆され、これらの役割分担が考えられた。Pyshell、Best、ACCase、および葉緑体分裂因子について発現抑制変異体の取得が進行中である。T. pseudonanaθ型炭酸脱水酵素2つの遺伝子破壊を行ったが、顕著な表現型は得られなかったが、エピソーム型ベクター型CRISPR/Cas9ニッカーゼ法を確立し実用化した。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後の実験には引き続き海洋性珪藻二種、P. tricornutumおよびT. pseudonanaを用いる。研究全体を今後も以下のサブプロジェクトに分け遂行する。
①光アミノ酸（PAA）による感光架橋性人工アミノ酸を珪藻タンパク質合成系に取り込ませることによるピレノイドの光固定を引き続き行い、ピレノイド因子のリストアップをさらにすすめる。また、各因子の抗体作製および各因子に対する相互作用因子の芋づる式探索を引き続き進める。
②リストされた候補から二次葉緑体移行シグナル（ASAFAPモチーフ）を持つものを優先的に選抜し、これらの遺伝子を取得する。この遺伝子にGFPなどの蛍光タンパク質遺伝子を融合し、GFP蛍光による細胞内局在確認を行う。また、透過型電子顕微鏡（TEM）を用いた免疫TEM観察で局在を詳細に決定する。2019年度に見出された新奇ピレノイド因子群について局在決定を完了する。
③すでに局在確認したタンパク質（Pyshell、Best、ACCase、θ型炭酸脱水酵素）から順に、2019年度に用法を確立したCRISPR/Cas9ニッカーゼ法によるゲノム編集を行い、これら新奇ピレノイド因子が持つ、細胞の環境応答性、光合成、生育に対する影響を定量的に測定し機能決定する。このように、引き続き一つひとつの新奇因子の機能同定を経ながら、特に2020年度以降は上記Pyshell、Best、ACCase、およびθCAを含めた④葉緑体構造・機能・動態モデル化および⑤これら因子が環境ゲノム内に及すインパクトの推定を開始する。
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