| 研究課題/領域番号 |
19H01178
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| 研究機関 | 慶應義塾大学 |
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研究代表者 |
尾上 弘晃 慶應義塾大学, 理工学部(矢上), 准教授 (30548681)
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| 研究分担者 |
倉科 佑太 東京工業大学, 物質理工学院, 助教 (40801535)
舟橋 啓 慶應義塾大学, 理工学部(矢上), 准教授 (70324548)
山田 貴大 慶應義塾大学, 理工学部(矢上), 助教 (20837736)
三浦 重徳 東京大学, 生産技術研究所, 特任講師 (70511244)
藤田 淳 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 特任准教授 (10306706)
遠山 周吾 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 特任講師 (90528192)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | in vitro組織成熟化 / 力学刺激 / iPS由来心筋組織 / 機械学習 / 単一細胞イメージング |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は，力学刺激によるin vitro 3次元心筋組織の成熟化のプロセスにおいて，計算機制御された力学刺激培養装置と単一細胞ライブイメージング，深層学習およびベイズ的最適化を駆使することより，迅速かつ効率的・効果的なin vitro組織の高度成熟化の実現，およびその方法論を創出すること，である．本研究により，従来，実験者による網羅的な条件検討が実験の主流であった生物学，組織工学の実験分野において，イメージング技術（センシング）・情報処理（インテリジェンス）・機械制御（アクチュエーション）を導入することにより，網羅的な条件探索することなく効率的に組織成熟化のプロセスを最適化し，高度な再生医療目標の実現への技術的貢献を目指す．本年度はファイバ状心筋組織への力学刺激の確立と単一細胞ライブイメージング可能な力学刺激装置の構築を中心に研究課題を遂行した．マイクロ流体デバイス技術と高純度ヒトiPS由来心筋細胞を用い，コアシェル型アルギン酸ゲルマイクロチューブ内に，直径100 um，長さ数m程度のファイバ形状の3次元心筋組織の形成と安定した培養条件を策定した．その際，心筋細胞に対し培養液から液性因子などの刺激などを与えることで組織が安定するとの知見を得ることができた．同時に，3次元組織に対して引張刺激を印加可能な力学刺激装置を開発し，2019年度予算により備品として購入した共焦点顕微鏡上でライブイメージング可能な実験セットアップの構築を完了した．引張可能な培養チャンバ内に繊維芽細胞を3次元的に培養して組織を形成し，その組織内の一部の細胞を遺伝子導入により細胞核と細胞膜を蛍光タンパクプローブで標識することで，引張刺激による細胞の形態変化を単一細胞レベルで観測することに成功した．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
①-1 ファイバ状心筋組織への力学刺激の確立：マイクロ流体デバイス技術と高純度ヒトiPS由来心筋細胞を用い，コアシェル型アルギン酸ゲルマイクロチューブ内に，直径100 um，長さ数m程度のファイバ形状の3次元心筋組織の形成と安定した培養条件を策定した．その際，心筋細胞に対し培養液から液性因子などの刺激などを与えることで組織が安定するとの知見を得ることができた．またファイバ状組織を培養チャンバに固定する技術を確立し，ライブイメージング可能であることを確認した． これは年度当初の計画どおりであり，純情に進展していると言える．
①-2 単一細胞ライブイメージング可能な力学刺激装置の構築：組織に対して引張刺激を印加可能な力学刺激装置を開発し，2019年度予算により備品として購入した共焦点顕微鏡上でライブイメージング可能な実験セットアップの構築を完了した．引張可能な培養チャンバ内に繊維芽細胞を3次元的に培養して組織を形成し，その組織内の一部の細胞を遺伝子導入により細胞核と細胞膜を蛍光タンパクプローブで標識することで，引張刺激による細胞の形態変化を単一細胞レベルで観測することに成功した．これは年度当初の計画どおりであり，純情に進展していると言える．
②-1 細胞のイメージング画像からの指標の取得：当該年度は，次年度以降に大量のイメージングデータが取得されることを踏まえ，機械学習を用いることで顕微鏡画像から3次元培養組織の状態を推定する学習器の実装を行った．具体的には，正常な状態の細胞画像のみを学習器に与えることで．異常な状態にある細胞を自動的に検知する学習器の試験的実装を行った．これは年度当初の計画どおりであり，純情に進展していると言える．
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度は以下の項目に取り組む．
（１）単一細胞ライブイメージング可能な力学刺激装置の構築
昨年度に開発した力学刺激培養装置にライブイメージングを適用する．束ねたファイバ状心筋組織の両端を把持して力学刺激を印加し，それと同時に共焦点顕微鏡を用いて単一細胞レベルでライブイメージングを可能とする装置の開発を行う．ファイバ状3次元組織への力学刺激は，（i）機械的な伸長もしくは（ii）電気的刺激による収縮の2通りの力学刺激を用い，全て計算機によりPythonで記述したプログラムでの制御を行う．また心筋組織のライブ観察のために，共焦点顕微鏡の焦点距離内で培養可能な薄型チャンバを力学刺激装置と統合する．
（２） ベイズ的最適化による3次元組織培養のオンライン制御系の構築
心筋の成熟過程とその制御をブラックボックスと捉え，ブラックボックス最適化の手法の中で高い性能を誇るベイズ的最適化を用いることで高効率な実験条件の探索を行う．培養プラットフォームの構築の際，iPS由来心筋と併用して，骨格筋細胞やマウス心筋細胞のセルラインなどを用い，実験の試行回数を上げることで計画をスムーズにすすめる予定である．
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