| 研究課題/領域番号 |
19H02089
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| 研究機関 | 山形大学 |
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研究代表者 |
小沢田 正 山形大学, 大学院理工学研究科, 教授 (10143083)
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| 研究分担者 |
馮 忠剛 山形大学, 大学院理工学研究科, 准教授 (10332545)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | iPS細胞 / 分化・成長誘導制御 / ３次元ゲル包埋培養 / 超小型３次元振動ステージ / ３次元動的力学刺激環境 / ニューロン簡易移植モデル / in vitro移植シミュレータ / 移植性促進法 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では，iPS細胞を用いた再生移植治療に貢献するため，生きている培養細胞に対し，３次元動的マイクロ力学刺激環境を自在に付加可能な超小型３次元振動ステージ・アクチュエータシステムを開発し，これにゲル包埋３次元培養法を組合せ，これまでとは全く異なる機械力学的原理に基づくiPS細胞から神経細胞への分化誘導，立体ニューロンネットワーク構築，さらにこれらを統合した３次元ニューロンのアクティブ再生移植制御・in vitro(培養ディシュ内)シミュレータの開発に挑戦する。これにより，最近開始されつつある重篤な神経系疾患への神経細胞再生移植治療を強力に支援する画期的システムへの展開を目指す。
立体ねじれV型カンチレバーおよび立体π/2ねじれバイモルフカンチレバーを用いた３次元振動ステージシステムを開発・改良し，これまでより大変位化，広帯域化の可能性を見出した。また，コラーゲン・ゲルを用いた「ゆるやかな足場」による神経細胞３次元包埋培養法の確立に近づいた。ただし，蛍光観察の鮮明性には依然として難点が存在するため，ゲル濃度の調整・最適化による改善が必要である。この包埋培養ディッシュを開発した超小型３次元振動ステージ上に設置し，３次元的力学刺激を組織的に作用させることにより，ニューロンネットワークの３次元化を段階的に誘導する手法を開発中である。また得られた組織を「Neurolucida 360」を用い,３次元解析する手法を開発中である。
誘導される３次元中枢神経回路網を用いて，脊髄損傷再生移植治療を模擬するin-vitro移植モデルを新たに構築する。今後，開発した３次元振動ステージを用い，移植施術後のニューロンの生着性，連結融合性を促進する最適な３次元動的力学刺激環境の同定をめざす。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
超小型圧電３次元振動ステージスシステムの構築と最適化を行った。立体π/2ねじれバイモルフカンチレバー状に加工した振動子に，直交２軸方向それぞれの変位が制御できるように２箇所に複数の圧電素子を接着し製作する手法を考案した。培養ディシュをπ/2面内回転させることで実質３軸方向に刺激付加可能とした。これらの改善により，これまでより大変位化，広帯域化の可能性を見出した。これらのデバイスをCO2インキュベータ内に組込み制御することにより，種々の３次元動的力学刺激環境下で組織的に培養コントロールを行うことができるシステムの構築を行った。また新たに「3次元インターバル刺激切替制御装置」を開発し，振動付加時間や方向をコンピュータ制御可能とした。
コラーゲン・ゲルを用いた「ゆるやかな足場」による神経細胞包埋培養法の確立に近づいた。ただし，蛍光観察の鮮明性には依然として難点が存在するため，改善が必要である。この包埋培養ディッシュを上記の超小型３次元振動ステージ上に設置し３次元的力学刺激を組織的に作用させることにより，ニューロンネットワークの３次元化を段階的に誘導する手法を開発中である。また３次元解析ソフト「Neurolucida 360」を用い，３次元的評価の確立を目指している。
以上のシステムにより，マウス神経細胞については，動的振動刺激を付加した場合，ニューロンネットワークを広く伸展させる効果があることを確認した。ヒト神経細胞については，長時間振動刺激あるいはインターバル振動刺激を付加することで，運動神経細胞への分化・成長が促進されることが明らかになった。
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| 今後の研究の推進方策 |
３次元振動ステージスシステムを用いた力学刺激付加デバイスの性能向上をある程度図ることができたため，今後はこれを利用し，比較的培養が容易なマウスiPS細胞(APS0001)を用いた先導研究を行いつつ，そのノウハウの蓄積に基づきヒトiPS細胞(HPS0002)の神経細胞への力学刺激によるニューロンのネットワーク構築・制御法開発を目指す。さらに，コラーゲン・ゲル包埋培養時の染色観察の精度向上および移植モデル構築に向けたゲル構造最適化，モデル設計・試作，力学刺激付加デバイスのさらなる性能向上をも目指す。
特に今年度の具体的な実験研究では，iPS細胞から分化誘導された神経細胞の種々の力学刺激に対する反応や挙動を精査，検証し，３次元ニューロンのネットワーク構築・制御に最適な動的力学刺激環境の探索・確定を目指すものとする。また特に得られた組織を「Neurolucida 360」を用い,３次元解析する手法の確立を目指す。
一方，誘導される３次元中枢神経回路網を用いて，脊髄損傷再生移植治療を模擬するIn-vitro移植モデルを新たに構築し，その妥当性についての評価・検証を行う予定である。さらに，開発した３次元振動ステージを用い，移植施術後のニューロンの生着性，連結融合性を促進する最適な３次元動的力学刺激環境の同定をめざす。
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