研究課題
本研究では、クライオ電子顕微鏡を用いた構造解析のホストとして優れた特性（ゲストタンパク質を包摂でき、特徴的な構造の巨大分子であり、解析のノウハウが蓄積している）を有するヘモシアニンを用いて、分子量の小さなタンパク質の構造もクライオ電顕で決定できる手法を開発することを目指す。前年度までに、ヘモシアニン内部に存在するフリーのシステイン残基（Cys3246）を利用して、Ni-NTA基とHis6タグとの相互作用を利用して種々のHisタグ融合タンパク質をヘモシアニン内部に結合させる系や、マレイミド基を介して結合させたアジド基とアルキニル基を結合させたゲストタンパク質を共有結合させる反応系を構築した。2021年度はこれらの手法にてゲストを結合させたヘモシアニンの構造を電子顕微鏡にて観察した。ゲストとしてGFPをヘモシアニンに結合させ、超遠心分離によりヘモシアニンを精製したところ、GFPに由来する緑色の蛍光を発したことから、超遠心分離後もゲストが安定に結合していることがわかった。さらに、透過型電子顕微鏡によりその分子形状を観察したところ、多くの粒子が円状の会合構造を形成していた。10量体構造はゲストを包摂していないヘモシアニンと同様に容易にピックできる特徴的な構造を維持しており、以上の結果より、GFPを包摂したヘモシアニンが単粒子解析で粒子ピックする際の目印となり得る、有用なホストとして利用できることがわかった。本研究では、ヘモシアニン内部にゲストを包摂するための種々の方法を構築することができ、さらに、単粒子解析の際の有用なマーカー分子としての機能も維持できることを示すことができた。
令和3年度が最終年度であるため、記入しない。
すべて 2022 2021
すべて 雑誌論文 (4件) (うち国際共著 1件、 査読あり 4件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (13件) (うち国際学会 2件、 招待講演 2件)
The FEBS Journal
巻: in press ページ: in press
10.1111/febs.16354
巻: 289 ページ: 1118～1134
10.1111/febs.16237
Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry
巻: 85 ページ: 1995～2002
10.1093/bbb/zbab123
Scientific Reports
巻: 11 ページ: 1
10.1038/s41598-021-02899-4
