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本研究では，宿主として昆虫細胞を用いるもののバキュロウイルスを使用しない，アデノ随伴ウイルス (AAV) ベクターの新たな生産技術の構築について検討した．非増殖性の組換えAAVベクターは，AAVの2つのITR (inverted terminal repeat) の間に挿入した治療用遺伝子とAAVの調節タンパク質Repおよびキャプシドタンパク質Capの遺伝子を宿主細胞で発現させると生成する．本研究では，プラスミドベクターを用いてAAVのRep・Capタンパク質の遺伝子を昆虫細胞に導入し，Rep・Capタンパク質の発現について検討した．昨年度までに，Cap遺伝子の発現に人工イントロンを1つ，プロモーターを2つ使用して作製したAAVベクターを哺乳動物細胞に添加すると，AAVベクターは細胞に感染しレポーター遺伝子が発現することを示した．このことから，バキュロウイルスを用いなくとも，昆虫細胞を宿主としてAAVベクターを生産可能であることを明らかにした．
今年度は，Cap遺伝子の上流にプロモーターを1つ配置し，Cap遺伝子内に2つの人工イントロンを挿入することにより，選択的スプライシングを利用したCap遺伝子の発現を試みた．作製したCap遺伝子をRep遺伝子，2つのITRに挟まれたレポーター遺伝子とともに昆虫細胞にコトランスフェクションすると，AAVベクターを生産することができた．人工イントロンのスプライス部位の配列によっては，AAVベクターの生産量が非常に高くなることがわかった．作製したAAVベクターを哺乳動物細胞に添加すると，AAVベクターは細胞に感染し，レポーター遺伝子が発現した．これらのことから，2つの人工イントロンを挿入し選択的スプライシングを利用するCap遺伝子の発現が，AAVベクターの新たな作製法として利用できる可能性が示唆された．
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