|
【本年度の目的】
本年度は、d昨年度にひきつづきオニグモを対象としてその縦糸タンパク質遺伝子をクローニング（目標8kbp以上）する。また昨年度クローニングしたcDNAを用いて遺伝子組換えカイコを作出する。
【本年度の実績】
本年度は、当初計画に従って、まず茨城県つくば市においてオニグモ（Araneus ventricosusu)成体を屋外採取した。採取個体から、糸腺組織を採取してmRNA調整した。縦糸タンパク質遺伝子に特異的なプライマーを用いて逆転写し、SMART法にしたがって、テンプレートスイッチから2nd strand cDNA合成したのち、In-Fusion法により発現ベクターへのcDNAのディレクショナルクローニングを行った。なお、逆転写プライマー及びTSOは本年度新たに複数の配列を設計して使用した。cDNAクローニングから、コロニーハイブリダイゼーションによるクモ糸タンパク質遺伝子を含むクローンの選抜を繰り返し、最終的に９クローンを選抜した。これらをすべてナノポアシーケンサによって配列解析したところ6クローンがMaSp2遺伝子、3クローンがMaSp3遺伝子であった。これらのうち、目的とする8kbp以上のクローンは５クローンであった。コガネグモについても同様に採取を行い、ｍRNAの精製まで完了した。
昨年度クローニング及び配列決定を行ったオニグモ縦糸タンパク質遺伝子クローン（MaSp2）について、遺伝子組換えベクターの構築と、遺伝子組換えカイコの作出を行った。遺伝子組み換えカイコの作出は2回行い、それぞれ３および１系統の遺伝子組換えカイコ系統を得た。現在、導入遺伝子のホモ化を進めている。
|
